美洲大蠊提取液调控大鼠难愈合创面微丝、桥粒实验研究*

美洲大蠊提取液调控大鼠难愈合创面微丝、桥粒实验研究*

曾娟妮杨敏2刘筱2李文华2周雯婷2

（1湖南中医药大学第二附属医院，湖南长沙410208；2湖南中医药大学，湖南长沙410005）

【摘要】目的：研究美洲大蠊提取液作用下创面新生细胞中微丝与桥粒的变化。方法：应用透射电镜观察创面愈合过程中不同组别伤口愈合部位细胞的微丝与桥粒的差异。结果：美洲大蠊提取液作用下的创面组织细胞的超微结构在数量、形态及结构上差异明显。结论：美洲大蠊提取液作用下的创面细胞超微结构显微形态较其他组更趋正常化。

【关键词】：美洲大蠊提取液；透射电镜；难愈合创面；超微结构

慢性难愈合创面，传统医学称其为“溃疡”，创伤患者因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，正损致腐，形成了虚、邪、瘀、腐相互作用、互为因果的变化，其中虚是受邪的条件及血瘀伤正的结果。经久不愈，损其正气，正虚邪盛，不能托毒外出，最终形成溃疡[1]。慢性难愈合创面已成为危害人类健康的公共问题，目前临床上仍缺乏有效简廉的治疗方法。细胞生长因子调节细胞外基质的合成与降解以及细胞增殖与凋亡是伤口愈合的关键[2]。目前,美洲大蠊提取物被广泛应用在创面修复、胃溃疡、肿瘤等领域[3-4]，现应用透射电镜观察难愈合创面愈合过程中不同时间点伤口基底细胞的超微结构（微丝、桥粒）。进一步验证美洲大蠊提取液促进慢性难愈合创面修复的作用优势，为临床推广应用美洲大蠊提取液防治慢性难愈合创面提供一种可靠的治疗方法和理论依据。

1、材料与方法

1.1试验材料

1.健康成年SPF级Wistar雄性大鼠42只（湖南中医药大学实验室提供，质量合格证NO.43004700026384），12周龄，体重220g～250g，适应性喂养1周。2.美洲大蠊提取液组所敷纱条用康复新液（湖南中南科伦药业有限公司国药准字Z43020995）。3.贝复济组所敷纱条用贝复济（珠海亿胜生物制药有限公司国药准字S10980075）。

1.2试验设计

1.2.1造模

参照付小兵等[5]全层皮肤缺损法经改进制成大鼠慢性难愈合创面模型。将42只大鼠随机分为：空白组（急性全层皮肤缺损组）10只、对照组（慢性难愈合创面组）32只。空白组大鼠根据模型建立方法在造模区行全层皮肤切除，但不注射氢化可的松；慢性难愈合创面组大鼠在造模区行全层皮肤切除后立即注射氢化可的松，制备慢性难愈合创面模型，造模成功后随机分为模型组10只、美洲大蠊提取液组11只和贝复济组11只，各组创面制备后即开始药物干预，并每天换药1次。

1.2.2药物干预方法

①美洲大蠊提取液组：创面外敷两层美洲大蠊提取液纱条（0.2ml/cm2），按创面大小剪成小块贴于创面上，再加盖两层消毒干纱布，胶布固定；

②贝复济组：创面外敷两层贝复济浸透纱布（60U/cm2），按创面大小剪成小块贴于创面上，再加盖两层消毒干纱布，胶布固定；

③模型组：创面外敷两层生理盐水纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上，加盖两层消毒干纱布，胶布固定；

④空白组：备皮处外敷两层生理盐水纱布，按备皮面积大小剪成小块贴于备皮处，加盖两层消毒干纱布，胶布固定，不作其他干预。

1.2.3取材

模型制备完成后，各组于3d、7d、15d、21d共4个时间点在4组分别随机取4只大鼠用20%乌拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉后，取造模区创面组织，空白组取备皮处的相应部位全层皮肤，深达筋膜层。所取组织样品在4°CPBS清洗，投入2.5%电镜级戊二醛固定液，备透射电镜观察。

1.2.4电镜观察

（1）取材：

组织块约1*1*3立方毫米

（2）固定：

2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时以上。用0.1M磷酸漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟，1%锇酸固定液固定1-2小时。用0.1M磷酸漂洗液漂洗3次，每次10-15分钟。

（3）脱水：

50%丙酮10-15分钟

70%丙酮10-15分钟

90%丙酮10-15分钟

100%丙酮15-20分钟，中间更换一次

（4）浸泡、包埋：

纯丙酮+包埋液（1：1）37度12小时

纯包埋液37度10-12小时

（五）固化：

37度烘箱内过夜

60度烘箱内12-24小时

（六）超薄切片机切片50-100nm

（七）3%醋酸铀以及硝酸铅双染色

（八）日立H7700透射电镜观察、拍片

图像采集均由中南大学湘雅医院电镜室代为完成。观察各组伤口愈合处基底细胞的显微形态。

2.结果

2.1分别观察同时间4组标本微丝、桥粒等超微结构，美州大蠊提取液组显示最佳，贝复济组次之，空白组更次，模型组最少。具体见图1、图2：

图14组同期（第7天）伤口愈合处基底细胞中微丝结果

图24组同期（第15天）创面桥粒结构结果

3结论

创面的愈合涉及炎症反应、白细胞、成纤维细胞、内皮细胞及上皮角质细胞等多种细胞的迁移、增殖和分化，细胞生长因子分泌，基质沉积等[6-7]，难愈合创面细胞的超微结构是潜在的创面愈合生长标志物，微丝(microfilament)是细胞运动的结构基础。微丝参与细胞分裂时收缩环形成，肌肉收缩,微绒毛,应变纤维,胞质环流和阿米巴运动,胞质分裂环。桥粒(bridgegranule)是维持细胞间连接，能阻止溶液中大分子沿着细胞间的缝隙渗入体内，维持细胞一个稳定的内环境。基于此，本实验以创面超微结构为出发点，运用透射电镜，分别观察4组创面标本组织细胞超微结构的数量、形态及性能，结果显示美洲大蠊提取液组与空白组及模型组由显著差异，与贝复济组有差异，即美洲大蠊提取物加速创面愈合在电镜观察下的特异性明显，更趋于正常化，对研究创面愈合机制具有指导性作用。

参考文献

[1]曾娟妮,谭达全,尹抗抗,唐乾利,王权胜.去腐生肌法治疗肛管慢性难愈合创面的临床研究[J]．新中医，2010，42(5):31-32．

[2]唐乾利,李辉,李杰辉,吕震,金萌,王宇,etal.,editors.MEBT/MEBO对糖尿病足溃疡创面超微病理及TGF-β1、smad3蛋白表达的影响.中国中西医结合学会烧伤专业委员会换届会议暨再生科学学术报告会;2015.

[3]尹彬.康复新联合奥美拉唑、阿莫西林胶囊三联疗法治疗消化性溃疡疗效分析[J].中外医学研究，2010,8（26）：17-18.

[4]刘宏宇.保留灌肠治疗放射性直肠炎48例疗效观察[J].中国医学创新，2010，7（3）：29-29.

[5]付小兵，孙同柱，盛志勇.几种用于创伤修复研究的动物模型[J].中华实验外科杂志，1999,16（5）:479-480.

[6]BauerSM,BauerRJ,VelazquezOC.Angiogenesis,vasculogenesisandinductionofhealinginchronicwounds[J].VascEndovascSurg,2005,39（4）：293-306.

[7]BrusselaersN,PirayeshA,HoeksemaH,etal.Serumreplacementinburns[J].JTrauma,2010,68（2）:490-501.