探讨荧光定量PCR法对结核杆菌检测效果分析

探讨荧光定量PCR法对结核杆菌检测效果分析

赵丽萍

逊克县疾病预防控制中心164499

【摘要】目的分析荧光定量PCR法（FQ-PCR）对结核杆菌的检测效果。方法整群选取2013年8月—2015年2月该院收治的126例临床确诊的结核杆菌患者作为观察对象，采集所有患者的痰液标本3份，分别进行FQ-PCR、涂片镜检及结核杆菌培养，对比3种检测方式的阳性率。结果FQ-PCR检测阳性率为61.90%，涂片镜检阳性率为36.51%，结核杆菌培养阳性率为40.48%，三组之间差异有统计学意义（P<0.01）。结论使用FQ-PCR对结核杆菌进行检测的准确率较高，值得开展。

【关键词】荧光定量PCR法；结核杆菌；检测效果

[Abstract]ObjectiveToanalyzethedetectioneffectoffluorescencequantitativePCR（FQ-PCR）forMycobacteriumtuberculosis.Methods126clinicallyconfirmedtuberculosispatientsadmittedtoourhospitalfromAugust2013toFebruary2015wereselectedasobservationobjects.Threesputumsampleswerecollectedfromallpatients.ThepositiveratesofFQ-PCR，smearmicroscopyandtuberculosisbacillusculturewerecompared.ResultsThepositiveratesofFQ-PCR，smearmicroscopyandcultureoftuberculosisbacilliwere61.90%，36.51%and40.48%，respectively.Therewassignificantdifferenceamongthethreegroups（P<0.01）.ConclusionTheaccuracyofdetectionofMycobacteriumtuberculosisbyFQ-PCRishigh，anditisworthcarryingout.

[Keywords]FluorescencequantitativePCR；Mycobacteriumtuberculosis；Detectioneffect

结核杆菌是引起结核病的主要病原菌，其具有特殊的细胞壁结构及类似于真菌的信号途径，对多种药物均具有天然的耐药性，且耐药机制复杂[1]。以往对结核病的诊断主要依靠临床症状、X光检查及痰涂片阳性，但诊断率较低，极易出现漏诊和误诊。该研究整群选取2013年8月—2015年2月收治的经临床确诊的126例结核患者，采用荧光定量PCR法（FQ-PCR）对结核杆菌进行检测，与痰涂片及结核杆菌培养相比较，以评价FQ-PCR在结核患者中的应用价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

整群选取经临床确诊的126例结核患者作为观察对象，其中男性72例，女性54例；年龄21～86岁，平均（45.69±9.87）岁；病程1～19年，平均（9.37±1.05）年；肺结核58例，结核性胸膜炎21例，骨与关节结核36例，淋巴结核11例；所有患者均完善相关检查，胸部X光及CT均示双肺纹理增多或增粗，临床症状均以咳嗽、咯痰为主，部分可见气急、胸闷、胸痛。

1.2仪器和试剂

包括奥林巴斯显微镜，国AB17300实时荧光定量基因扩增仪，上海飞鸽高速离心机，北京鼎国昌盛生物技术有限公司生产的分支杆菌DNA扩增试剂。

1.3标本收集及处理

1.3.1标本收集患者清晨起床后先给予清水漱口，后用力咳嗽，取第2口痰置于无菌器皿中，后立即送检。

1.3.2标本处理取其中一份痰标本加入2～4倍的浓度为4%的NaOH，充分摇匀，室温液化20min，取1mL以15000r/min的速度离心10min，后废弃上层清液，使用去离子水沉淀2次。外周血标本：往取得的血标本中加入5%EDTA-2K抗凝，以10000r/min的速度离心10min，将血浆废弃，后加入无菌高纯水溶解红细胞后以10000r/min的速度离心10min，废弃上层清液，下层备用。

1.4方法

1.4.1痰涂片镜检取其中一份痰标本的粘液部分或可疑部分0.1mL，在玻片正面右侧的2/3处均匀的进行涂抹，大小为10mm×20mm，形状为卵圆形，置于室温中自然干燥30min，加入石碳酸复红染液，3%盐酸酒精脱色，再使用吕氏美蓝进行复燃0.5min，涂片复染1～3min，水洗后待其自然干燥，后置于镜下进行查看。若淡蓝色背景下可见染红的细胞或略带弯曲的杆菌，且有分枝生长势态即为阳性。

1.4.2结核杆菌培养于安全柜内取0.5mL消化后的痰标本，置入无菌的BacT/ALERT3D培养管中，另加入0.5mL抗生素补充剂，后将培养管置入仪器中培养。培养出结核杆菌为阳性，余则为阴性。

1.4.3FQ-PCR检测采用25μL的反应体，Buffer2.5μL，MgCl26μL，dNTPs0.5μL，ForwardPrimer2μL，ReversePrimer2μL，TsqDNA聚合酶0.5μL，SybrGreen1μL，TemplatecDNA2μL，TOtal：25μL。β-actin反应条件：预变性为94℃2min，变性为94℃30s，退火为63℃30s，延伸为72℃30s，以此为周期循环35次。扩增条件：预变性为94℃2min，变性为94℃30s，退火为64℃30s，延伸为72℃30s，以此为周期循环40次。操作结束后采用阳性梯度标准品的循环阈值为标准对结果进行判读，<38为阳性，38～39为可疑，40阴性。

1.3观察指标

为3种检测方式的阳性率。

1.4统计方法

所有数据均由SPSS13.0软件处理，计数资料比较用χ2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

FQ-PCR检测阳性率为61.90%，痰涂片镜检阳性率为36.51%，结核杆菌培养阳性率为40.48%。其中痰涂片镜检与结核杆菌培养差异无统计学意义（χ2=0.42，P>0.05）；FQ-PCR检测与痰涂片镜检阳性率差异有统计学意义（χ2=16.26，P<0.01）；FQ-PCR检测与结核杆菌培养阳性率差异有统计学意义（χ2=11.58，P<0.01）。

3讨论

结核分枝杆菌又被称为结核杆菌，是导致结核病的主要原因，可牵连全身多个器官，诱发患者出现全身性疾病，其中以肺结核最为多见[2]，给患者、家庭、社会均造成严重的影响。对结核分枝杆菌进行检测是临床对结核进行诊断和鉴别结核与其他病变的重要手段，而结核分枝杆菌近几年呈现较大的变异性，致使抗结核药物的耐药性也逐渐加大[3]。因此，探索一种方便而有效的检测方式，尽早对患者进行确诊，帮助患者及早治疗尤为重要。目前，对结核杆菌进行检测主要包括涂片染色镜检、结核杆菌培养和FQ-PCR检测法3种。该研究对收治的126例临床诊断的结核患者的痰标本分别采用涂片染色镜检、结核杆菌培养和FQ-PCR检测3种方法进行检测，FQ-PCR检测阳性率为61.90%，痰涂片镜检为36.51%，结核杆菌培养阳性率为40.48%，均明显高于姜晚云[4]的检测结果，可能与痰标本搜集及消化处理方法不同有关。痰涂片和痰培养具有简单、快捷、耗材小、价格低的优点，故是临床较为常用的检测方式，但两种方式对标本质量的要求和操作人员的技术要求均较高，其中痰涂片的敏感性较低，且特异性较差，痰培养的灵敏度明显高于痰涂片，被称为检测结核病菌的金标准[5-7]，但该方式所需时间较长，且灵敏度也不尽人意。FQ-PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时对整个PCR进程进行监测，使每一个循环步骤均成为可见状态，最后通过循环阈值和标准曲线对样品中的DNA或cDNA的起始浓度进行定量的方法。采用FQ-PCR法对结核患者痰标本进行检测，整个操作过程全在封闭状态下进行，可有效的避免因产物污染导致的假阳性的发生，且该方式自动化程度较高，PCR反应及相应的结果分析均由计算机自动完成，故检测结果更为精确。胡静等[8]对通过FQ-PCR对结核患者的体液进行检测，假阳性率仅为11.1%，说明该方式的准确度也较高。因此，FQ-PCR可作为结核杆菌检测的常规方式，值得推广。

参考文献：

[1]杨小蓉，陈少莲，卢景辉，等.荧光定量PCR检测结核杆菌PncA基因突变研究[J].临床医学工程，2013，20（12）：1482-1485.

[2]韩文灿，郑茂金，郭羽白，等.荧光定量PCR检测石蜡组织中结核杆菌的临床应用[J].徐州医学院学报，2014，34（12）：868-870.

[3]张建武，魏存乐，吉焕英，等.结核PCR定量测定在结核病诊断中的应用[J].北方药学，2013，10（10）：58-60.

[4]姜晚云.荧光定量PCR技术在结核杆菌检测中的应用[J].中外医学研究，2014，12（14）：65-66.

[5]吴驰，张红梅，詹能勇，等.荧光定量PCR技术在肺结核诊断中的临床应用研究[J].中国防痨杂志，2010，32（10）：647-650.

[6]邹自英，朱冰，汤雪晴，等.结核杆菌的细菌学、分子生物学和免疫学检测方法评价[J].四川医学，2011，32（5）：756-758.

[7]段静，王艳，袁杭，等.结核杆菌五种实验室检测方法比较[J].现代检验医学杂志，2014，29（4）：79-82.

[8]胡静，袁文清.PCR技术检测体液中结核分枝杆菌的结果分析[J].国际检验医学杂志，2013，34（5）：588-589.