端粒酶活性联合DNA异倍体检测在良恶性腹水鉴别诊断中的价值

端粒酶活性联合DNA异倍体检测在良恶性腹水鉴别诊断中的价值

陈建1罗蕾蕾1薛亚晶2

陈建1罗蕾蕾1薛亚晶2

（1南通市第三人民医院消化内科江苏南通226006；2南通市肿瘤医院检验科江苏南通226000）

【摘要】目的通过联合检测腹水端粒酶活性与流式细胞仪DNA异倍体检测，探讨两种检测方法在良恶性腹水鉴别诊断中的价值。方法收集良恶性腹水标本，使用端粒酶活性检测试剂盒检测端粒酶活性，使用流式细胞仪检测DNA异倍体。结果端粒酶活性检测和DNA异倍体检测诊断恶性腹水的敏感度分别为82.35%、78.43%，特异度分别为94.87%、97.87%。当同时联合两种检测方法，联合检测的敏感度可以达到96.07%，特异度和单个指标并无明显差异。结论端粒酶活性检测和DNA异倍体检测可以作为良恶性腹水鉴别诊断的有效方法。同时联合端粒酶活性检测和DNA异倍体检测可以增加恶性腹水的检出率。

【中图分类号】R730.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）23-0087-02

端粒酶活性与肿瘤的发生密切相关，人类90%的肿瘤组织存在异常端粒酶活性，而正常组织细胞端粒酶活性低，甚至无端粒酶活性，因此端粒酶是一个不受组织器官限制的肿瘤标志物[1，2]。

人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变[3，4]。异倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。测量和分析细胞核DNA含量与倍体对恶性肿瘤的病理诊断、恶性程度判定、疗效估价、预测预后具有重要价值[5，6]。

本研究通过联合检测腹水端粒酶活性与流式细胞仪DNA异倍体检测，探讨两种检测方法在良恶性腹水鉴别诊断中的价值。

1资料和方法

1.1一般资料

2010年1月至6月在南通市第三人民医院、南通市肿瘤医院共收集90例腹水标本，恶性腹水为51例，良性腹水为39例。良性腹水中肝硬化腹水为36例，结核性腹水3例。恶性腹水中肝癌为25例，胃癌8例，大肠癌9例，胰腺癌2例，卵巢癌6例，腹膜癌1例。所有病例均经过临床诊断和病理诊断确诊。

1.2方法

1.2.1取腹水标本20ml，加入PBS洗涤，3000rpm，离心20min，弃去上清，加入细胞裂解液，冰浴30min，16000rpm离心20min吸取上清-70℃保存，待端粒酶活性检测。取腹水标本100ml均加入PBS洗涤，3000rpm离心10min，去细胞悬液，调整细胞数为106/ml，75%乙醇4℃封存，待DNA异倍体检查。

1.2.2端粒酶活性检测:按TeloTAGGGTelonerdsePCRELISA试剂盒说明书进行操作，取PCR产物在聚丙烯烷胺凝胶电泳出现间隔6bp的梯形条带为端粒酶活性阳性。

1.2.3DNA倍体分析:使用流式细胞仪检测，以新鲜分离的健康体检者外周血淋巴细胞DNA荧光信号主峰值作为二倍体细胞DNA含量参考值，应用MulticycleDNA含量与细胞周期分析软件提示DNA所示二倍体主峰完全分离的荧光信号（DNA指数≠1）定义为阳性，提示受检腹水标本中含DNA异倍体。

1.3统计学方法:所有数据均应用SPSS统计软件处理，P<0.05为有显著性差异。

2结果

2.1良恶性腹水中端粒酶活性检测的差异

在良性腹水中，有2例端粒酶活性阳性，阳性率为5.12%，而在恶性腹水中共检测出现42例阳性，阳性率为82.35%。恶性腹水的端粒酶活性阳性率明显高于良性腹水（χ2=52.74，p<0.05）。

2.2良恶性腹水中DNA异倍体检测的差异

在良性腹水中，有1例出现异倍体，阳性率为2.56%，而在恶性腹水中共40例检测出异倍体，阳性率为78.43%。恶性腹水异倍体检出率明显高于良性腹水（x2=51.28，p<0.05）。

2.3两指标联合在良恶性腹水中的差异

通过联合端粒酶活性检测和DNA异倍体检测，联合检测对恶性腹水诊断敏感度达96.07%，明显高于单个指标（χ2=4.99，p<0.05)，特异度为94.87%，和DNA异倍体相同，和单个指标无明显差异(χ2=0.34，p>0.05)。

两指标诊断恶性腹水诊断的特异度敏感度

指标阳性数敏感度特异度

端粒酶活性4282.3594.87

DNA异倍体4078.4397.44

两指标联合4996.0794.87

2.4良性腹水病例随访一例

在良性腹水病例中，有一例肝硬化腹水病例端粒酶活性和DNA异倍体均为阳性，予以随访半年后患者并未发现恶性肿瘤依据。

3结论

端粒酶是负责维持端粒长度的酶，在人类体细胞增殖的潜力是有限的，在50-70个细胞分裂达到衰老，因为DNA聚合酶是无法复制DNA在染色体的末端。相反，在大多数肿瘤细胞复制的潜力是由于端粒酶激活导致维持端粒的长度，导致细胞的永生化，这被认为是肿瘤发生过程中一个重要的过程[7]。所以，端粒酶活性检测被认为是肿瘤诊断的一个有效的诊断方法。目前在包括胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌等均发现了端粒酶激活[8]，这也是恶性腹水能检测端粒酶活性阳性率明显高于良性腹水的原因。

流式细胞术（FCM）是目前较常用DNA定量分析的实验室技术之一.流式细胞术是利用流式细胞仪对微小生物颗粒物的多种物理、生物学特性进行定量、分析检测的技术，FCM可精确定量DNA含量的改变，是诊断恶性肿瘤一个有非常有价值的实验室方法，有助于良恶性的鉴别诊断[9]。流式细胞仪检测DNA含量分析诊断恶性腹水已见报道，但综合文献，流式细胞仪DNA定量分析对恶性胸、腹水诊断的敏感性研究报道不一[10，11]。

我们的研究表明:端粒酶活性检测和DNA异倍体检测诊断恶性腹水的敏感度分别为82.35%、78.43%，特异度分别为94.87%、97.87%。两种检测方法均可以作为良恶性腹水鉴别诊断的有效方法。当同时联合两种检测方法，联合检测的敏感度明显高于单个检测指标，联合检测的敏感度可以达到96.07%，然而特异度和单个指标并无明显差异，所以同时联合端粒酶活性检测和DNA异倍体检测可以增加恶性腹水的检出率，为恶性腹水的及时诊断治疗可以提供帮助。

参考文献

[1]EDonnell，DErnst，RHingorani.Multiparameterflowcytometry:advancesinhighresolutionanalysis.ImmuneNetwork.2013；13(2):43–54.

[2]BaichooE，BoardmanLA.Towardamolecularclassificationofcolorectalcancer:theroleoftelomerelength.FrontOncol.2014；15(3):3389-3400.

[3]NesiG，BrunoL，SaievaC，etal.DNAploidyandS-phasefractionasprognosticfactorsinsurgicallyresectedgastriccarcinoma:a7-yearprospectivestudy[J].AnticancerRes.2007；27(6):4435-4441.

[4]AraujoSE，BernardoWM，Habr-GamaA，etal.DNAploidystatusandprognosisincolorectalcancer:ameta-analysisofpublisheddata[J].DisColonRectum.2007；50(11):1800-1810.

[5]SusiniT，AmunniG，MolinoC，etal.Ten-yearresultsofaprospectivestudyontheprognosticroleofploidyinendometrialcarcinoma:dNAaneuploidyidentifieshigh-riskcasesamongtheso-called'low-risk'patientswithwellandmoderatelydifferentiatedtumors[J].Cancer.2007Mar1；109(5):882-890.

[6]MoraJ，LavarinoC，AlaminosM，etal.ComprehensiveanalysisoftumoralDNAcontentrevealsclonalploidyheterogeneityasamarkerwithprognosticsignificanceinlocoregionalneuroblastoma[J].GenesChromosomesCancer.2007Apr；46(4):385-396.

[7]MocellinS，PooleyKA，NittiD.Telomerase?andthesearchfortheendof?cancer[J].TrendsMolMed.2013；19(2):125-133.

[8]BernardesdeJesusB，BlascoMA.Telomerase?attheintersectionof?cancer?andaging[J].TrendsGenet.2013；29(9):513-520.

[9]MetzeK.Fractaldimensionofchromatin:potentialmoleculardiagnosticapplicationsforcancerprognosis[J].ExpertRevMolDiagn.2013；13(7):719-735.

10.MotherbyH，PomjanskiN，KubeM，etal.DiagnosticDNA-flow-vs.-image-cytometryineffusioncytology[J].AnalCellPathol.2002；24(1):5-15.

[11]KrishanA，Ganjei-AzarP，JordaM，etal.Detectionoftumorcellsinbodycavityfluidsbyflowcytometricandimmunocytochemicalanalysis.DiagnCytopathol[J].2006；34(8):528-541.