重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5的构建及病毒包装

重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5的构建及病毒包装

冯晓勤阮永胜周小辉

冯晓勤阮永胜周小辉（南方医科大学南方医院儿科广东广州510515）

【中图分类号】R58【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）50-0077-02

【摘要】目的构建小鼠CXCR3的重组腺病毒载体。方法应用RT-PCR方法从小鼠脑组织中扩增分离CXCR3基因，经双酶切位点插入腺病毒载体pacAd5中，经氨苄青霉素抗性筛选、酶切及DNA测序方法验证目的基因。采用Lipofectamine?2000将重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5转染HEK293AD细胞，包装、扩增后测定病毒滴度。结果RT-PCR方法获得1.1Kb目的基因CXCR3，经氨苄青霉素抗性筛选的重组克隆经酶切及DNA测序证实为目的基因。重组CXCR3/pacAd5转染HEK293AD细胞后获得包装及扩增，病毒滴度达1.8×108PFU/ml。结论本研究成功构建小鼠CXCR3的重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5，可用于进一步研究CXCR3参与多种疾病转归的分子免疫机制。

【关键词】趋化因子受体CXCR3腺病毒载体

趋化因子受体是一种由7个亚单位组成的跨膜蛋白，属于G蛋白偶联受体超家族，主要表达于白细胞，亦可以表达于上皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等结构细胞表面参与细胞的增殖、生长和迁移等生理功能；趋化因子受体需在趋化因子的作用下，激活选择素/整合素等粘附分子，诱导细胞的粘附、穿透血管内膜及向炎症部位的迁徙[1,2]，此外，趋化因子受体还参与肿瘤的发生、发展及向远处转移[3,4]。趋化因子受体以CXC型和CC型趋化因子受体为两个最主要的亚族，CXCR3属于CXC亚族，在病毒感染、自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤等病理生理过程中发挥重要作用[5-7]。本研究拟构建CXCR3/pacAd5的重组腺病毒载体并包装病毒，用于转染功能细胞，从而进一步研究CXCR3参与多种疾病转归的分子免疫机制。

1材料和方法

1.1主要材料

质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、DNAMarker(北京艾德莱公司),Taq聚合酶、T4DNA连接酶、dNTPMix、限制性内切酶XbaI、BamHI及RTKIT（MBI公司)，琼脂糖和LB培养基（LifeTechnology公司），Trizol、测序和引物合成（INVITROGEN公司），DEPC（SIGMA公司），pacAd5CMVK-NpA(简称pacAd5)表达质粒、DH5α感受态细胞（本室保存）。

1.2小鼠CXCR3基因的克隆

取出50-100mg新生小鼠的脑组织，在液氮中速冻数秒，将组织在研磨碗中研碎。加入1mlTrizol提取总RNA。在200?lPCR反应管中依次加入RNA抽提物3μg，加DEPC水至体积15ul在PCR仪上70℃10分钟，依次加入RNasin1μl、Oligo(dT)15随机引物、10mMdNTP1μl、5×RT缓冲液5μl、MMLV逆转录酶1μl，42℃60分钟，95℃5分钟逆转录RNA。PCR反应：根据Genebank公布的小鼠Cxcr3基因序列（GenBankNM_009910.2），设计引物:上游引物为5'-CGCGGATCCATGTACCTTGAGGTTAGTGAAC-3'(插入BamHI位点)，下游引物为5'-TGCTCTAGATTACAAGCCCAGGTAGGAGGCC-3'(插入XbaI位点)。取RT产物2ul，配制50ulPCR反应体积，94℃5分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃90秒35个循环，72℃10分钟，4℃保存PCR产物，取1-2ul1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因CXCR3，回收目的基因片段（按说明书方法进行）。

1.3重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5的构建将回收的PCR产物及腺病毒pacAd5穿梭载体（详见图1）进行BamHI及XbaI的双酶切反应，连接反应将目的基因CXCR3插入腺病毒pacAd5穿梭载体构建重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5。将重组载体转化进入DH5α感受态细胞，向管中加入1mlLB液体培养基(不含氨苄青霉素Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。将细菌沉淀混匀后涂布于含Amp+的LB筛选平板上,正面向上放置,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃过夜培养。

1.4阳性重组克隆的筛选与鉴定

分别挑取2-3个克隆于5mlLB（Amp+）液中培养过夜，按试剂盒说明方法小量制备提取质粒，加入限制性内切酶消化质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察酶切片断大小。

纯化回收目的基因DNA，送上海invitrogen公司测序。

1.5重组腺病毒的包装、扩增和滴度的测定

腺病毒载体的线性化：将CXCR3/pacAd5及pacAd59.2-100病毒载体经PacI酶切消化，酶切产物用0.8%的琼脂糖凝胶进行分离，以确认病毒载体是否被线性化。转染：接种2×106的HEK293AD细胞于60mm培养皿中，16-24小时后，待其融合密度达70%-80%时，采用Lipofectamine?2000进行转染。Lipofectamine?2000、CXCR3/pacAd5以及pacAd59.2-100使用量分别为16ul、6.4ug和1.4ug（详见LipofectamineTM2000操作指南）。第二天更换新鲜的完全培养基。继续培养细胞一般不要超过15天，待50%的细胞飘起，收集细胞及上清。扩增：收集的细胞及上清，经-80℃/+37℃反复冻融3次，收集上清液中包含的重组腺病毒。接种5×106的HEK293AD细胞于100mm培养皿中，次日加入50%得到的初级腺病毒上清液，感染24-48小时，待出现明显的细胞病理效应(CPE)时，收集细胞，经-80℃/+37℃反复冻融3次，弃沉淀再次收集上清液，此时上清包含扩增好的重组腺病毒。重组腺病毒滴度的测定：采用50%细胞培养感染剂量法(CCID50)测病毒滴度：将HEK293接种于96孔板，每空细胞数为8000个。次日用含2%FBS的DMEM连续稀释扩增好的病毒上清液，感染细胞，病毒的最终稀释度分别为：10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3，同时每个稀释度病毒感染组预留两空不做感染作为阴性对照，细胞继续培养10天，10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。根据Spearman-Karber法计算重组腺病毒滴度，LgCCID50/0.2ml=-(X0－d/2＋d×∑R1/N1)，LgCCID50/ml=LgCCID50/0.2ml+0.7，其中X0=全部病变最低稀释度对数、d=稀释因数对数、N1=每个稀释度所种的孔数、R1=病变孔数。

2结果

2.1RT-PCR产物进行1%琼脂糖电泳，在大小约为1.1Kb处为单一条带（图1），跟目的片断大小位置相符。

图1RT-PCR扩增CXCR3cDNA(M,DNAMarker;1,CXCR3cDNA)产物

MARKER从上至下，分别为2000，1000,750,500,250,100bp

2.2阳性重组克隆CXCR3/pacAd5的筛选与鉴定

克隆CXCR3基因插入腺病毒pacAd5穿梭载体（见图2）构建重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5，挑取3个重组克隆酶切结果如图3，CXCR3/pacAd5重组质粒经EcoRI/NotI双酶切鉴定后，获得1.1Kb的酶切片断，跟扩增的CXCR3目的片断大小相符。重组克隆1测序结果与CXCR3阅读框序列（GenBankNM_009910）一致。

图3CXCR3/pacAd5表达载体的酶切鉴定图(M,DNAMarker；1-3,CXCR3/pacAd5cutbyBamHI/XbaI)。

2.3重组腺病毒滴度测定：采用CCID50法，按照Spearman-Karber公式计算，重组腺病毒CXCR3/pacAd5滴度为：1.8×108PFU/ml。

3讨论

近年来对趋化因子及其受体的研究显示，趋化因子受体通过与趋化因子蛋白结合,经GTP偶联蛋白发挥相应的生物学功能,如维持细胞存活、诱导基因表达、引导细胞迁移、促进新生血管形成从而参与病毒感染、自身免疫疾病、肿瘤的发生发展及转移等的分子免疫病理机制。因此，多种针对趋化因子受体的靶向治疗策略的研究已在热烈地展开，如趋化因子拮抗剂、趋化因子抗体、免疫调节剂对趋化因子受体的影响以及基因治疗的研究已有陆续报道。CXCR3是趋化因子受体CXC亚族的典型代表，本研究选择克隆小鼠CXCR3基因并构建CXC3的重组病毒载体，意在为上述靶向治疗奠定研究基础。

本研究选择腺病毒载体，因为腺病毒载体宿主范围广,致病性低，可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。常用的逆转录病毒只能感染增殖性细胞，腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型,与人类基因同源，不整合到染色体中,无插入致突变性，能有效进行增殖,滴度高，能在悬浮培养液中大量扩增，而且能同时表达多个基因，正是由于具有上述优点,腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。

本研究成功克隆小鼠CXCR3基因并构建了重组腺病毒载体CXCR3/pacAd5，重组腺病毒CXCR3/pacAd5滴度达1.8×108PFU/ml。为后续转染增殖及非增殖细胞，进行CXCR3分子功能研究及基因治疗奠定实验基础。

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