自贡地区金葡菌qacA基因检测

自贡地区金葡菌qacA基因检测

孙卫东1章成1（通讯作者）周廷权2杨军1

孙卫东1章成1（通讯作者）周廷权2杨军1

（1四川省自贡市第四人民医院老年科四川自贡643000）

（2重庆医科大学附属第一医院感染科重庆400016）

【摘要】目的:了解自贡地区近两年临床分离的金黄色葡萄球菌中耐药基因qacA的携带情况。方法:采用CLSI推荐的30mg头孢西丁纸片法进行耐甲西林金黄色葡萄球菌（MRSA）鉴定，采用PCR技术检测qacA基因。结果：临床分离的143株金黄色葡萄球菌中65株为MRSA(其中qacA基因阳性率为10.8％)，共有9株qacA基因呈阳性(阳性率为6.3％)。结论:自贡地区临床分离的金黄色葡萄球菌中qacA基因携带率低于国外文献报道，与国内文献报道一致。

【关键词】金黄色葡萄球菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；耐药基因qacA

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）17-0044-03

Epidemiologyofdisinfectant-resistantgeneqacAinStaphylococcusaureusinZigongAreaSunWeidong,ZhangCheng,YangJun.

The4thPeopleHospitalofZigongCity,SichuanProvince,Zigong643000,China;ZhouTingquan.TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing404100,China

【Abstract】0bjectiveToinvestigatethedisinfectant—resistantgeneqacAinStaphylococcusaureusisolatesfromZigongMunicipalofSichuan．MethodsAtotalof143S.aureusstrainswereisolated.Diskdiffusionmethodwasusedtoidentifymethicillin-resistantS．aureus(MRSA)．PCRwasemployedtoanalyzetheprevalenceofqacAgeneinthesestrains.ResultsOfthe143S．aureusstrains，9werepositiveforqacAgene．TheprevalenceofqacAinthesestrainswas6.3％.TheprevalenceofqacAgeneinMRSAwas10.8％．ConclusionsTheprevalenceofqacAgeneintheclinicalisolatesofS.aureusinthehospitalsofZigongMunicipalislowerthanthereportedresultsabroadandconsistentwithdomesticreportedoutcome.

【Keywords】Staphylococcusaureus;Methicillin-resistantStaphylococcusaureas;Disinfectan-resistantgeneqacA

细菌耐药已经成为全球性公共卫生问题。细菌耐药可以导致医疗费用增加、病死率上升，更为严重的是耐药菌可能使人类重新面临感染性疾病的威胁。金黄色葡萄球菌(金葡菌Staphylococcusaureus)是引起医院感染的重要病原菌。自上世纪九十年代初以来医院感染中金葡菌检出率呈现逐年上升趋势。人是金葡菌的天然宿主，因而处于遭受感染的高危状态。事实上，多数医院感染的发生正来自医护人员的手[1]。研究表明，临床已分离出携带耐药基因如qacA的金葡菌临床分离株。qacA基因编码多重耐药蛋白，介导许多药物的耐药。为了解自贡地区金葡菌中耐药基因qacA的流行状况，我们对近两年自贡地区三甲医院临床分离的143株金葡菌进行了qacA基因检测。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1细菌来源所测细菌菌株为自贡市第一人民医院、第四人民医院2011-2012年临床分离的金葡菌143株，菌株来自各科室住院患者，其中痰液(56株)、创面分泌物(24株)、脓液(17株)、尿液(16株)、咽试子(16株)、血液(9株)、其他(5株)，剔除同一患者相同部位的重复菌株。qacA阳性菌株Ts77由日本东京药科大学病原微生物教研室野口雅久教授赠送。MIC质控菌金葡菌ATCC29213和金葡菌ATCC25923为重庆市传染病寄生虫病研究所保藏。

1.1.2试剂和产地

1.1.2.1PCR试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)、蛋白胨(日本制药株式会社)、牛肉浸膏(上海长阳生化制药厂)、EDTATris(重庆北碚化学试剂厂)、琼脂糖(宝生物工程有限公司)、头孢西丁(重庆药检所提供)。

1.1.2.2DNAMarker：2000、1500、1000、800、700、600、500、400、300、200、100（bp）为上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.2.3qacA基因的PCR扩增引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)根据PUBMED基因库中公布的基因序列用primer5．0设计引物(通用引物)：

F：5'-GCTGCATTTATGACAATGTTTG一37，629bp；

R：5’一AATCCCACCTACAAAGCAG一3’

1.1.3主要仪器PCR仪(MJresearchPTC-200)，核酸电泳仪（CLP）、天平(北京医用天平厂)、超净台(苏净集团安泰公司)、恒温箱(南京实验仪器厂)、凝胶成像系统(BIORAD)、电子天平(ABl04-N)、制冰机(日本SANYON公司)、微型离心机(Eppendorf)。

1.2方法

1.2.1MRSA和MSSA的筛选

采用CLSI推荐的30mg头孢西丁纸片法进行鉴定，35℃孵育24h，有>1个菌落为耐药，用透射光仔细检查有无菌落或薄膜状生长。质控菌金葡菌ATCC29213为敏感株，TS77为耐药株。

1.2.2PCR基因扩增试验

1.2.2.1PCR扩增模板制备：挑取纯培养平皿单个菌落于100?L消毒ddH2O中，制成金葡菌悬液，从中吸取1?L悬液作PCR模板。

1.2.2.2反应条件：热循环参数为93℃预变性2min，然后93℃30s-55℃30s-72℃60s，循环35周期，最后一个循环72℃延长至5min，总反应体积为50?L。

1.2.2.3扩增产物电泳鉴定：PCR扩增产物作2％琼脂糖凝胶电泳，80/6V/CM，时间30min，加样5mL，紫外凝胶电泳成像仪下观察并记录结果。PCR产物测序送重庆医科大学感染性疾病分子生物学重点实验室测序。

2.结果

2.1检测结果

2.1.1MRSA和MSSA143株金葡菌中，65株为MRSA，占45．5％(65／143)；78株为MSSA，占54．5％(78／143)。

2.1.2基因检测MRSA中发现qacA基因阳性株7株，占10.8%(7／65)，MSSA中有2株，占2．6％(2／78)。阳性株测序后与阳性对照株的序列相同。

2.1.3基因型检测电泳图见图1(629bp)。

3.讨论

医院感染是公共卫生、医疗管理者最为关注的医疗问题之一。金葡菌是感染的重要病原菌，2010年全国细菌耐药监测结果显示革兰阳性菌中，金葡菌检出率位居第一。近年来有关金葡菌对药物抗性的研究较为深入，已发现金葡菌中存在多种主动外排系统。主动外排系统能够使细菌呈现对多种化学结构完全不同的药物高度耐药。金葡菌含有多种药物抗性质粒，主要有编码NAB核酸结合质粒、pSKl质粒、重金属抗性质粒等。根据其抗性情况及DNA同源性可将位于金葡菌不同质粒上的抗性决定因子分为两大家族：qacA/qacB家族及qacC/qacD家族。在qac家族中，除对消毒剂耐药外，对多种抗菌药物存在高耐药率[2-5]。本研究分析了自贡地区三甲医院分离出的65株MRSA中qacA检出率为10.8％(7/65)，低于近年国外的报道[6-7]。1990年Rouch等在金葡菌中检测出qacA基因[8]，Noguchi等1999年在日本的调查中发现MRSA中qacA的检出率为10.2％(10/98)，2001年Mayer等3在欧洲部分医院的调查中发现MRSA中qacA/B的检出率高达62.6％(186/297)[9]，2007年Miyazaki等发现MRSA中qacA/B的检出率达到80％[10]。综上所述，细菌对某些消毒剂的抗性和对抗菌药物的耐药性可能存在联系。目前普遍认为，消毒剂的滥用、使用剂量不规范和处理方法不当是细菌产生消毒剂抗性的主要原因。因此，在应用消毒剂时，以一次性杀菌为宜。此外，缘于细菌在长时间脱离接触某消毒剂后，对该药的抗性可能会消失，故最好几种消毒剂交替使用。深入研究抗性机制，对于探讨高效低毒消毒剂的研制与合理应用，消除细菌对消毒剂/抗菌药物的抗性的问题有十分重要的意义。

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[9]MayerS，BoosM，BeyerA，eta1．Distributionoftheanti-septicresistancegenesqacA，qacBandqacCin497methicillin-resistantand-susceptibleEuropeanisolatesOfStaphylococcusaureus[J]．JAntimicrobChemother，2001，47(6)：896-897．

[10]MiyazakiNH,AbreuAO，MatinVA，eta1．ThepresenceofqacA／BgeneinBrazilianmethicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]．MemInstOswaldoCruz，2007，102(4):539-540．

基金项目：四川省科技厅项目资助（编号：2010FZ0102）

作者单位：1四川省自贡市第四人民医院老年科

2重庆医科大学附属第一医院感染科

通讯作者：章成E-mail:bdztq1982@163.com