阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊抑制HBV及所致肝损伤作用的研究

阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊抑制HBV及所致肝损伤作用的研究

吕晓莉

（长春市第二医院药剂科吉林长春130000）

【摘要】目的：探讨阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊对HBV的抑制及其所致肝损伤的保护作用及其机制。方法：复制HBV携带小鼠模型，采用扶正化瘀胶囊单独及联合阿德福韦酯干预，利用荧光定量检测小鼠血清HBVDNA，ELISA检测血清HBsAg、HBeAg水平。复制HBV小鼠肝损伤模型，对比扶正化瘀胶囊和甘利欣对该模型血清ALT、AST及肝脏HE染色的影响，并采用WesternBlot检测与免疫炎症反应相关的肝组织FOXP3、IL-23、IL-17A表达。结果：HBV携带小鼠血清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg水平在扶正化瘀胶囊单独作用及联合阿德福韦酯后明显下降。扶正化瘀胶囊及甘利欣能有效降低HBV诱导肝损伤后ALT、AST的升高。在HE染色中扶正化瘀组较模型组病变程度减轻，可见肝脏充血，局部有炎症细胞浸润，但坏死较模型组减轻。通过WesternBlot检测发现扶正化瘀胶囊可以使该模型FOXP3、IL-23、IL-17A表达减少。结论：扶正化瘀联合阿德福韦酯具有良好的抗HBV的作用。扶正化瘀同时能逆转HBV所致肝损伤，其作用有可能与抑制FOXP3、IL-23、IL-17A表达有关。

【关键词】扶正化瘀；阿德福韦酯；乙型肝炎病毒；FOXP3；IL-23；IL-17A

【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）25-0063-03

乙型肝炎是全世界流行的传染疾病，据最新的世界卫生组织报道全球有约20亿人感染过HBV，并有65万人死于由此导致的肝硬化、肝衰竭及肝癌的疾病[1-2]。这使得乙肝感染的防治日益成为了突显的社会问题。近年的研究表明病毒性肝炎时肝细胞存在着凋亡及坏死，体内多种细胞因子水平升高，进一步增加了肝损伤。中医为我国的国宝，实际上我国对中医中药治疗HBV的研究并不少见，大量研究认为中药治疗乙肝的机制主要是调节免疫、保护肝脏等。杨氏发现何首乌、大黄、丹参等66中单味药具有抑制HBV的作用。而蔡永江等也发现了芪蓝扶正解毒剂可以使HBsAg转阴。扶正化瘀胶囊是由桃仁、五味子、丹参、发酵虫草菌粉等为主要成分的中药制剂。其在组成中有与上述研究中提及的中药成分，以往的研究中也报道了扶正化瘀胶囊能通过抑制星状细胞的活化而减轻肝纤维化。但目前尚未见对乙型肝炎病毒抑制的报道。本文研究了扶正化瘀胶囊对HBV的抑制作用，并对其机制进行了初步的探索，为临床的治疗提供新的理论依据。

1.材料与方法

1.1主要试剂和仪器

C57BL/6小鼠购自河北省实验动物中心（许可证编号:SCXK冀2008-1-003）。HBV质粒PAAV/HBV来源，BiovectorCo.LTD。化瘀胶囊，上海黄海制药厂，国药准字200Z20073；乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒，深圳匹基生物工程有限公司；HBsAg、HBeAgELISA检测试剂盒，华美生物公司；阿德福韦酯，福建广生堂药业股份有限公司（20070198）；ALT、AST检测试剂盒，广州标价科技有限公司；Purifiedanti-humanFOXP3、Anti-humanIL-23p19，美国Biolegend；Anti-humanIL-17A，美国R&D；FITC-标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司；Model1680酶联免疫检测仪，Bio-Rad；全自动生化分析仪，BECKMAN；倒置显微镜，日本OLYMPUS；电泳供电装置PowerPac、165-8001型伯乐小型垂直电泳槽、221BRTrans-BoltSD半干转印槽、ChemiDoxXRS凝胶成像系统，美国Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1复制HBV携带鼠模型选取4～6周健康C57BL/6小鼠，置于白炽灯下照射10min，以便小鼠血管扩张，尾静脉更易暴露，之后向尾静脉注射3ug/ml的HBV质粒PAAV/HBV2ml，整个注射过程在8s内完成。正常饲养4周采用摘除眼球采血收集小鼠血清定量检测HBsAg，HBsAg阳性的小鼠即为HBV携带鼠模型制造成功[3]。

1.2.2实验分组筛选造模成功的HBV携带鼠60只，随机分为4组。空白对照组每日给予生理盐水2ml腹腔注射，扶正化瘀组按吴硕[4]的方法将扶正化瘀胶囊配成0.1g/ml的水溶液后，并按2mg/g给予小鼠腹腔注射。阿德福韦酯组给予40mg/kg腹腔注射。阿德福韦酯联合扶正祛瘀组给予两种药物腹腔注射。连续给药28天。在给药前、给药后14天、给药后28天、停药后7天，每组随机选取3只小鼠断头采血，分离血清后置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3HBVDNA的荧光定量检测将100ul各组血清与等量的处理液A加入离心管中混匀后于13000g离心10min，弃去上清液，加入25ul处理液B，混匀后于2000r/min离心10s，置于100℃干浴10min，13000g再次离心10min，提取上清液。经95℃变性30sec，60℃退火30sec，70℃延伸30sec，37℃1sec进行40个循环。荧光采集通道选FAM和HEX，采集温度60℃，由计算机计算出DNA含量。

1.2.4小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平测定使用ELISA试剂盒检测小鼠血清HBsAg、HBeAg，将试剂盒与待测血清置于室温1h，按上述分组将小鼠血清50ul加入加样孔，之后加入酶标结合物50ul充分混匀。贴上封膜，37℃孵育30min。弃去空中内容物，在滤纸上拍干，然后注满洗液，静置20s甩去洗液，拍干，如此反复5次。每孔加入显示剂，封膜后37℃孵育，避光显示15min，每孔加入50ul终止液。使用酶标仪在450nm处进行结果判读。

1.3扶正化瘀对HBV所致小鼠急性肝损伤的保护作用

1.3.1急性肝损伤模型制备将20只C57BL/6小鼠随机分为4组。模型组、扶正化瘀组、甘利欣组按照上述方法复制HBV携带小鼠模型。扶正化瘀组给予0.1g/ml的扶正化瘀水溶液，并按2mg/g灌胃，甘利欣组给予100mg/kg灌胃，阴性对照组及模型组每只小鼠给予0.5ml/d生理盐水灌胃。持续3天，禁食水12h后断头采血，收集血清及肝脏以备后续实验。

1.3.2ALT和AST检测将上以步骤收集的各组小鼠血清离心后用全自动生化分析仪检测肝功指标ALT、AST。

1.3.3肝脏形态学观察将一部分肝脏固定于10%的福尔马林溶液中。二次取材后流水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋、切片、HE染色、中性树胶封片、光学显微镜观察。

1.3.4Westernblot肝脏组织称重后仔细研碎，按3ml/g组织加入RIPA缓冲液，及浓度为10mg/ml的PMSF30ul/g肝脏组织。之后于4℃，15000rpm离心1min。再次加入PMSF，冰浴30min。移入离心管再次4℃15000rpm离心15min，收集上清液。利用Bradford比色法测定蛋白浓度。至胶、上样后开始电泳，选择电压200V，时间1h。取出凝胶后进行电转移，叠放PVDF膜和滤纸后设定半干式电转移电压10V，时间50min。电转完毕后4℃封闭过夜，一抗孵育、二抗孵育、显色、显影定影后描述结果。

1.4统计学分析

应用SPSS19.0统计软件及Excel2007进行数据分析，方差分析，结果以表示，以P＜0.05视为具有统计学意义。

2.结果

2.1HBVDNA的荧光定量检测

下图1为扶正化瘀以及阿德福韦酯给予HBV携带鼠腹腔注射后不同时段检测到HBVDNA荧光定量的结果。根据结果所示，各药物组小鼠腹腔注射药物期间HBVDNA荧光定量逐渐减少，停药后出现HBVDNA反弹，与对照组相比具有明显差异（P＜0.05）。其中扶正化瘀与阿德福韦酯联合应用时HBVDNA荧光定量的降低量最明显。

图1HBVDNA荧光定量结果（x-±s，n=3）

*与对照组相比P＜0.05。

2.2小鼠血清中HBsAg、HbeAg水平测定

下图为试剂盒对小鼠血清中HbsAg及HbeAg的检测结果。如图2所示使用扶正化瘀后同一时间内随浓度的增加HbsAg的量逐渐减少，同一浓度作用时间延长后HbsAg的水平也会下降，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）。阿德福韦酯较扶正化瘀抑制HbsAg的能力强。但两者联合后HbsAg下降趋势更加显著。图3中HbeAg水平也随扶正化瘀浓度及作用时间的增加而下降，与对照组相比具有明显的差异（P＜0.05）。阿德福韦酯比扶正化瘀作用抑制HbeAg的能力强，但停药后两者之间的差别不大。但两者联合后停药后可见对HbeAg能力仍要较强。

图2HbsAg测定结果（x-±s，n=3）

*与对照组相比P＜0.05。

图3HbeAg测定结果（x-±s，n=3）

*与对照组相比P<0.05。*VScontrolP<0.05

2.3扶正祛瘀对急性肝损伤小鼠转氨酶影响

如表1所示各组与阴性对照组相比均具有明显差异，证明HBV诱导急性肝损伤小鼠模型成功。而扶正化瘀组、甘利欣组与模型组相比具有明显差异证明扶正化瘀和甘利欣具有缓解肝损伤作用，但两者之间并无明显差异。

表1扶正化瘀对小鼠血清ALT和AST的影响（x-±s，n=5）

*与阴性对照组相比P<0.05。▲与模型组相比P<0.05。

2.4HE染色

如图2.4所示，模型组的肝脏HE染色切片显示肝脏纤维化、炎症细胞浸润，肝脏充血，局部有局灶性肝细胞坏死。扶正化组较模型组病变程度减轻，可见肝脏充血，局部有炎症细胞浸润，但坏死减轻。甘利欣组与扶正化瘀组病变程度接近，可见少量炎症细胞浸润，坏死减少。

图2.4肝脏HE染色（×100）

2.5WesternBlot

如图4，图5所示，为利于Westernblot检测FOXP3、IL-23、IL-17A的表达情况。阴性对照组与模型组相比具有明显差异可见模型复制成功，扶正化瘀组及甘利欣组的三种蛋白表达与阴性对照组相比明显增高，但少于模型组，上述结果具有统计学差异（P＜0.05）。

图4Westernblot检测FOXP3、IL-23、IL-17A的表达

（1、对照组；2、模型组；3、扶正化瘀组；4、甘利欣组）

图5Westernblot检测FOXP3、IL-23、IL-17A的表达的灰度值

*与阴性对照组相比P<0.05。#与模型组相比P<0.05。

3.分析

扶正化瘀胶囊具有活血化瘀、益精养肝的功效，能够显著改善肝功能[5]。同时其在抗肝纤维化方面的作用早已被熟知[6]。但是扶正化瘀胶囊与HBV感染后的关系，目前研究甚少。本实验当中首先利用HBVDNA的荧光定量检测及乙型肝炎病毒s、e抗原诊断试剂盒对HBV携带小鼠血清进行了检测，结果发现扶正化瘀作用后小鼠血清中的HBVDNA及病毒抗原明显下降，证明了其抗乙肝病毒的能力，之后复制了HBV感染所致肝损伤模型，发现扶正化瘀一方面具有降低转氨酶的作用，另一方面肝脏病理发现炎症浸润及肝细胞坏死明显减少。进一步证明了扶正化瘀胶囊在保护HBV所致肝脏损伤方面的作用。乙肝病毒作用机体后如何导致肝细胞的凋亡。近年来通过大量的研究发现HBV本身并不能导致细胞的凋亡，而是通过机体对HBV抗原的免疫应答实现肝细胞的损伤，故机体的免疫状态对于HBV感染后的结果至关重要[7]。其中目前研究的比较多的就是FOXP3+Treg，HBV病毒进入机体后会产生特异的FOXP3+Treg细胞，后者诱导机体对HBV的免疫耐受，最终造成HBV在机体的持续感染。一般情况下FOXP3+Treg可以通过STAT3途径来抑制致病性Th17的反应，还可以直接抑制RORγt来促进IL17细胞的分化。而IL-23/IL-17A参与了慢性乙型肝炎病毒感染的炎症过程。故FOXP3与IL-23/IL-17A在HBV感染中存在联系。我本利用Westernbolt检测发现扶正化瘀是通过减少体内FOXP3、IL-23、IL-17A表达而进一步起到保护肝脏的作用。二者在机体促进炎症反应但中起到了协同作用。临床当中亦有检测替比夫定治疗52周后患者血清中三种炎症因子的表达情况，结果发现三种因子随HBV感染的控制也趋于下降。故本实验证明，扶正化瘀具有抗HBV的作用，而且其作用可能是通过影响FOXP3、IL-23、IL-17A的表达而实现的。

【参考文献】

[1]OttJJ,StevensGA,GroegerJ,etal.GlobalepidemiologyofhepatitisBvirusinfection:newestimatesage-specificHBsAgseroprevalenceandendemicity[J].Vaccine.2012;30:2212-9

[2]LozanoR,NaghaviM,ForemanK,etal.Globalandregionalmortalityfrom235causesofdeathfor20agegroupsin1990and2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancer,2012,380:2095-128.

[3]吕树娟.HBV-CpG诱导抗乙型肝炎病毒免疫应答[M].中国科学技术大学.2013

[4]吴硕.扶正化瘀方对肝纤维化小鼠肝细胞中Nrf2表达的影响[M].山东大学.2013

[5]LiuYK,ShenW.Inhibitiveeffectofcordycepssinensisonexperimentalhhepaticfibrosisanditspossiblemechanism[J].WorldJGaStroenterol,2003,9(3):529-533

[6]XieH,TaoY,LvJ,etal.Proteomicanalysisoftheeffectoffuzhenghuayurecipeonfibroticliverinrats.EvidBasedComplementAlternatMed.2013;2013:972863.

[7]AWLohse,CWeiler-Normann,GTiegs.Immune-mediatedliverinjury[J].JournalofHepatology.2010,52:136-44.

作者简介：吕晓莉，长春市第二医院药剂科，副主任药师.