载体介导的RNAi技术对HL-60细胞hTERT基因和细胞增殖的影响

载体介导的RNAi技术对HL-60细胞hTERT基因和细胞增殖的影响

高吉照许伟郭雷李艳卢立慧薛天阳

高吉照许伟郭雷李艳卢立慧薛天阳

徐州医学院附属医院儿科医院江苏徐州221002

摘要：目的探讨由载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术对白血病HL-6细胞hTERT基因和细胞增殖的影响。方法用已经构建好的表达针对hTERT基因siRNA的质粒载体，经转染试剂RNAi-Mate转染HL-60细胞；以空质粒、转染试剂及空白组作对照，将转染后24h、72h、120h的细胞作为三个实验组，用RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA的表达，MTT检测细胞增殖活性。结果三个实验组HL-60细胞hTERTmRNA表达水平低于各对照组，细胞增殖活性抑制率高于各对照组（P＜0.05），实验组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；三个对照组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术能在体外抑制HL-60细胞hTERT基因的表达，抑制细胞增殖。

关键词：端粒酶逆转录酶；RNA干扰；HL-60细胞；hTERT基因表达；细胞增殖抑制率

AbstractObjectiveToexploretheeffectofRNAitechnologytargetinghTERTbyvectoronhTERTgeneexpressionandcellproliferativeofleukemiaHL-60cell.MethodshTERT-siRNAplasmidthathasbeenstructuredwastransferedintoHL-60cellsbyRNAi-Mate，theemptyplasmid，transferingreagentandblankcellswereusedascontrol.Cellswerecollectedat24h，72h，120haftertransfered，andRT-PCR，Western-blotwereusedtodetecttheexpressionofhTERTmRNAandhTERTprotein，flowcytometrywasusedtoobservetheapoptosis，MTTassaywasusedtoobservetheproliferativeeffectsofcells.ResultshTERTmRNAexpressionoftestgroupsat24h，72h，120haftertransferedwere0.31±0.08，0.28±0.05，0.32±0.06respectively，expressionlevelofemptyplasmid，transferingreagentandblankgroupswere0.55±0.13，0.49±0.08，0.58±0.19respectively.Comparedwithcontrolgroups，hTERTmRNAintestgroupswassignificantllow（P＜0.05）；comparedwithblankgroup，hTERTmRNAintheemptyplasmidandtransferingreagentgroupshadnosignificantchange（P＞0.05）.TheantiproliferativeeffectsofRNAiinHL-60cellsin24h，72h，120htestgroupswere（23.7±4.0）%、（35.1±5.9）%、（29.6±3.8）%，theywere（3.7±0.8）%、（2.1±0.5）%、（2.7±0.9）%intheemptyplasmidgroup，（4.0±1.8）%、（2.6±1.3）%、（2.2±1.1）%intransferingreagentgroupandinblankgroup，all0.Theantiproliferativeeffectsofcellsintestgroupswerehigherthanthatincontrolgroups（P＜0.05）；comparedamongthethreetestgroups，therehadnodistinguishedchange（P＞0.05）；comparedwithblankgroup，theantiproliferativeeffectsintheemptyplasmidandtransferingreagentgroupshadnodistinguishedchange（P＞0.05）in24h，72h，120h.ConclusionRNAitechnologytargetinghTERTbyvectorcouldinhibittheexpressionofhTERTgeneandproliferationactivityofHL-60cellinvitro.

KeywordshTERT；RNAi；HL-60cell；expressionofgene；cellproliferation

分子生物学技术的发展以及对肿瘤发病机制认识的深入，肿瘤的基因治疗越来越受到医学界的重视。本研究利用载体介导的靶向hTERT基因的RNAi技术，检测其对白血病HL-6细胞hTERT基因、蛋白表达、细胞凋亡和增殖活性的影响，探讨儿童白血病的基因治疗。

1材料和方法

1.1主要材料和试剂HL-60细胞株购自中科院上海细胞所，RMPI1640购自美国Gibco公司胎牛血清购自杭州四季青生物公司，质粒pSilencer1.0-U6购自美国Ambion公司，转染试剂RNAi-Mate购自上海吉玛制药技术有限公司，pSilencer1.0-U6/hTERT由徐州医学院附属医院泌尿外科郑骏年博士惠赠[1]，

RT-PCR试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，AnnexinV-FITC试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司，碘化丙啶（PI）购自美国Sigma公司，恒温培养箱购自美国Thermoelecrton公司，倒置显微镜CH20型购自日本Olympus，PCR反应仪购自美国PE公司，752紫外光栅分光光度计购自上海第三分析仪器厂，低温超速离心机购自德国Eppendorf公司，WB电泳仪购自美国Bio-Rad公司，凝胶成象系统购自美国UVP公司，酶标仪美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1实验分组：对照组：（1）pSilencer1.0-U6空质粒组，（2）RNAi-Mate转染试剂组，（3）0.9%氯化钠溶液空白对照组；实验组：pSilencer1.0-U6/hTERT质粒转染24、72、120h组。

1.2.2细胞培养HL-60细胞采用含10%胎牛血清、青霉素100×103U/L、链霉素100×103g/L的RPMI1640培养基，在5%CO2、饱和湿度、37℃条件下培养，细胞融合80%～90%时按1：4比例传代。

1.2.3pSilencer1.0-U6/hTERT转染HL-60细胞，收集传至第3代的HL-60细胞，离心后弃上清液，用RPMI1640培养液调整细胞密度为2.0×105个/ml。取用无血清培养液稀释的pSilencer1.0-U6/hTERT和pSilencer1.0-U6质粒DNA0.8μg、RNAi-Mate2.4μg（RNAi-Mate：DNA为3：1）混合，于37℃培养30min；将细胞悬液加入以上复合物，按实验分组于37℃继续培养不同时间。

1.2.4RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA表达

收集各组细胞，按照总RNA提取试剂盒说明进行RNA提取，分别取RNA4μg，按照RT-PCR试剂盒说明进行逆转录和PCR仪扩增，每管样品对应配制一管内参照β－actin。hTRET上游引物序列：5′-TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3′，hTRET下游引物序列：5′-GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA-3′，β－actin上游引物序列：5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，β－actin下游引物序列：5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。hTRET基因产物大小为202bp，β－actin基因产物大小为603bp，所用引物均由上海生物工程公司合成；反应结束后分别取反应液10?l，1%琼脂糖100V、50mA条件下电泳30min；置于凝胶成像系统进行分析。实验设4个复孔。

1.2.5MTT检测hTERT对HL-60细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，调整细胞密度为2×10个/mL，接种于96孔培养板中，分别在质粒转染后继续培养24h、72h、120h；加入20?lMTT（5mg/mL）20?L/孔，继续培养4h；离心后弃上清液，DMSO加入20?L/孔，振荡10min；在酶联免疫检测仪检测490nm处各孔的吸光度（D值），各组设7个复孔，按一下公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1-实验组平均D值/空白对照组平均D值）×100%。

1.3统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较采用SNK法检验，检验水准：α=0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1RT-PCR检测各实验组HL-60细胞hTERTmRNA表达水平低于空质粒转染组、转染试剂组和空白对照组（P＜0.05），三个实验组之间和三个对照组之间hTERTmRNA表达水平无明显差异，组间比较差异无统计学意（P＞0.05）。见表1，图1。

EffectofhTERT-siRNAonhTERTmRNAexpression

1：TransfectedwithpSilencer1.0-U62：RNAi-Mate3：Blankcontrol

4-6：TransfctiectedwithpSilencer1.0-U6/hTERTfor24，72and120h，respevely；

图1RT-PCR检测细胞hTERT基因mRNA表达

Fig.1ExpressionsofhTERTmRNAindifferentgroupsdetectedbyRT-PCR

表1各组HL-60细胞hTERTmRNA表达

Table1ExpressionofhTERTmRNAofHL-60cellsindifferentgroups（n=4，±s）

GroupExpressionofhTERTmRNA

A0.55±0.13

B0.49±0.08

C0.58±0.19

D0.31±0.08﹡

E0.28±0.05﹡

F0.32±0.06﹡

A：TransfectedwithpSilencer1.0-U6B：RNAi-MateC：BlankcontrolD-F：TransfectedwithpSilencer1.0-U6/hTERTfor24，72and120h，respectively；﹡P<0.05，VSA，BandCgroups.

2.2载体介导的靶向hTERTRNAi抑制HL-60细胞的增殖MTT法检测结果显示，各实验组HL-60细胞中的增殖抑制率高于空质粒转染组、转染试剂组和空白对照组（P＜0.05），三个实验组和三个对照组之间的细胞增殖抑制率无明显差异（P＞0.05）。见表2。

3讨论

RNAi（RNAinterference）是双链RNA导入细胞后引起的与该RNA同源的mRNA降解的过程[2]。既往研究表明，利用RNAi技术能特异性抑制癌基因、突变基因、抗凋亡基因的过度表达，使这些基因保持沉默，从而起到抗肿瘤的作用[3～6]，且不良反应小，作用稳定，能更有效、特异地抑制肿瘤基因的表达[7]。端粒酶催化端粒的自我复制以维持端粒的长度，与肿瘤的发生有

表2MTT法检测各组HL-60细胞的增殖抑制率

Table2TheinhibitoryrateofHL-60cellproliferationindifferentgroupsdetectedbyMTTassay[n=7，（±s）/%]

A：TransfectedwithpSilencer1.0-U6；B：RNAi-Mate；C：TransfectedwithpSilencer1.0-U6/hTERT；

﹡P<0.05VSAandBgroups

密切联系[8～9]，其过度表达可使肿瘤细胞持续分裂和增殖。hTERT是端粒酶的限速酶[10]，抑制hTERT基因的表达可以降低端粒酶的活性，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖，因此，hTERT基因是肿瘤基因治疗的理想靶点，通过针对肿瘤细胞hTERT基因的RNAi，可沉默hTERT基因，从而达到抗肿瘤的目的[11]。本研究结果显示，3个实验组HL-60细胞均出现hTERT基因表达降低、细胞增殖抑制增加，说明hTERTRNAi重组质粒成功介导了HL-60细胞hTERT表达下调。

既往有究把体外合成的针对hTERT的RNAi转染到白血病细胞株，能产生RNAi效果，但作用时间短，转染后1～2天效果基本消失[12]。本研究以重组载体质粒介导的靶向hTERT的RNAi作用时间较体外合成的RNAi明显延长，作用时间持续120h仍无减弱，主要是因为质粒通过自我复制，使RNAi得到扩增，克服了体外合成的RNAi不能持续表达的缺陷。本研究为小儿白血病的基因治疗提供的实验依据。

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