HPV原位杂交技术的应用体会

HPV原位杂交技术的应用体会

裴芝娟吴鹏(通讯作者)

（浙江省肿瘤医院病理科310022）

【关键词】原位杂交；人乳头状瘤病毒；探针

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）35-0078-02

宫颈癌是全球妇女中仅次于乳腺癌居第2位的恶性肿瘤，是最常见的女性生殖道恶性肿瘤。作为目前唯一一个病因明确的妇科恶性肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV）的持续感染相关[1]。HPV病毒是一种环状双链DNA病毒，具有球形外壳，直径55nm，长约8kb[2]。主要感染皮肤粘膜上皮，导致不同病变。目前已经鉴定的HPV病毒超过200种[3]，至少50种与生殖道粘膜感染相关。依据不同型HPV与癌发生的危险性高低分为低危险型HPV如HPV6，11等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变（CINI）；高危险型HPV如HPV16，18，31，33等与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变（CINII/CINIII）的发生相关，尤其是HPV16、18型。因此，高危型HPV检测具有很高的临床意义。

目前HPV-DNA病毒学检测的方法很多，包括：免疫组化（IHC），杂交捕获（HC），原位杂交（ISH），聚合酶链式反应(PCR)等。比较而言，在临床病理学中HPV检测的原位杂交技术具有较大的优势。现将实验中的操作体会与大家共同探讨。

1.材料与方法

1.1材料拟行HPV原位杂交的活检标本，经10%中性缓冲福尔马林固定，常规组织处理，4微米连续切片粘附于APES或多聚赖氨酸涂胶片上，65℃烤箱烤片备用。

HPV高危型、低危型试剂盒购自正规试剂公司。苏泊尔不锈钢压力锅（18cm），电磁炉，柠檬酸盐抗原修复液（Citrate缓冲液），PBS缓冲液。

1.2方法：

1.2.1脱蜡至水包括：(1)二甲苯：10分钟×2～3次。（2）100％乙醇：2分钟。（3）95％乙醇：2分钟。（4)80％乙醇:2分钟。（5）70％乙醇：2分钟。（6）双蒸水：2分钟×3次。

1.2.2加热预处理：（1）电磁炉压力锅煮片（压力锅喷气后计时1～3分钟），或微波炉高火15～30分钟（2）双蒸水洗片：2分钟×3次。

1.2.3梯度乙醇脱水包括：（1）70％乙醇：2分钟。（2）80％乙醇：2分钟。（3）95％乙醇：2分钟。（4）100％乙醇：2分钟。（5）100％乙醇：2分钟。（6）室温干燥20分钟。

1.2.4组织、探针变性和杂交：（1）杂交膜中央滴加15～20μl的探针。（2）将加有探针的杂交膜轻盖在组织上避免产生气泡。（3）封片胶密封杂交膜边缘。（4）玻片置原位杂交仪或PCR仪95℃变性5～10分钟后37℃孵育过夜（至少超过12小时）。（5）严格洗涤。（6）杂交后，小心去除封片胶和杂交膜。（7）0.5×SSC洗涤液（50%的甲酰胺及枸橼酸盐），室温下片刻。（8）0.5×SSC洗涤液，75℃5分钟（每多加一张切片，温度提高1度，最高不超过80℃）。（9）双蒸水冲洗2分钟×3次。

1.2.5免疫显色：（1）3％H2O2甲醇溶液：10分钟。（2）1×PBS/Tween20(0.025%)冲洗：2分钟×3次。（3）切片滴加抗DIG（地高辛）抗体：室温孵育40～60分钟。（4）1×PBS/Tween20(0.025%)冲洗：2分钟×3次。（5）滴加两HRP-IgG抗体：室温孵育30～40分钟。（6）1×PBS/Tween20(0.025%)冲洗：2分钟×3次。（7）DAB显色：2～10分钟（镜下观察）。（8）自来水冲洗2分钟。

1.2.6复染与封片：（1）苏木素复染：5秒～5分钟（具体时间因组织不同而异，复染过深会使阳性信号变得模糊）。（2）自来水冲洗：2分钟。

1.2.7梯度脱水：（1）70％乙醇：2分钟。（2）80％乙醇：2分钟。（3）95％乙醇：2分钟。（4）100％乙醇：2分钟。（5）100％乙醇：2分钟。（6）二甲苯透明：2分钟×2次。（7）中性树胶封片。

2.结果判读

阳性上皮细胞核呈棕褐色或棕黄色。HPV感染的细胞形态主要包括：核周空穴细胞（“挖空细胞”），角化不良细胞，湿疣样外底层细胞。将DNA检测结果与细胞及核形态学联系起来，可以区分弥漫型和颗粒型阳性信号，HPV整合状态呈颗粒型；HPV游离状态呈弥漫型。

3.讨论

近年来随着分子检测技术的发展，我们可从分子的水平更早期的、更准确地，检测出低拷贝数下的病毒感染情况[4]。该技术目前已广泛用于宫颈癌的早期的诊断及其它部位病变、病因学等方面的研究。原位杂交方法虽然容易掌握，但要达到满意结果，还需要在制片过程中注意以下几点。

3.1杂交前处理（1)切片不宜过厚，厚度3～4微米；(2)烤片温度宜60-65℃，时间大于1小时；(3)组织固定液采用10％中性缓冲福尔马林或4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液；(4)建议使用APES处理过的干净载玻片或多聚赖氨酸涂胶片，以减少脱片。（5）脱蜡、脱水试剂及时更换，保证组织脱蜡、脱水的干净。（6）建议高温高压煮片法热修复[5,6]。以提高组织通透性和探针穿透性，增强杂交信号，减少背景着色。如使用微波处理需高火及补充修复液防止干片。

3.2注意点(1)滴加探针液一般为15～20μl，加盖玻片宜缓慢小心，避免产生气泡。探针液过多造成浪费；过少易产生气泡，组织切片不能全部覆盖杂交液，杂交过程中造成干片；(2)杂交温度应控制在37℃，过高或过低会造成阳性信号减弱或背景升高；（3）杂交时间12～16H，建议过夜，以提高低拷贝数病毒的检出率；如时间过长，杂交后发生自动解链，其杂交信号反而减弱；（4）杂交后实验过程中多次PBS液洗涤，可有效去除非特异性结合的探针片段，背景更干净，而且节省时间；（5）滴加试剂一定要在湿盒中进行以防止组织干片（6）DAB液要现配现用，保证显色效果；（7）在显微镜下控制显色时间和程度，以减少非特异性背景显色。

本文介绍的这种原位杂交技术方法简便、易掌握、显色强、脱片现象得到有效控制，极少产生非特异性着色，背景清晰、干净，复染后颜色对比清晰，易于诊断，值得病理同仁们探讨使用。

【参考文献】

[1]王伯沄，李玉松，黄高昇等.病理学技术［M］.北京：人民卫生出版社，2000：117-121.

[2]KongCS，WehonML，LongacreTA．Roleofhumanpapilloma-virusinsguamouscellmetaplasiadysplasiacarcinomaoftherec-tum[J]．AmJSurgPathol，2007，31：919—925．

[3]ChienCY．SuCY，FangFM，eta1．Louerprevalencebutfavorblesurvialforhumanpapillomvirus-relatedsgumouscellcarcinomaoftonsilintaiwan[J]．OralOncol，2006，10：1016-1021．

[4]郎景和．人乳头状瘤病毒感染的处理[M].妇科学新进展．北京：中华医学电子音像出版社，2005：83-89．

[5]粱晓俐．病理学基础与实验技术.北京：军事医学出版社．2003：195-197.

[6]纪小龙，施作霖．诊断免疫组织化学．北京：军事医学出版社．1997：14-16．