抑癌基因在乳腺细胞系的表达及遗传学调控研究

抑癌基因在乳腺细胞系的表达及遗传学调控研究

郑桂玉

郑桂玉（汕头大学医学院广东汕头515041）

【摘要】目的探讨抑癌基因在乳腺细胞系的表达及遗传学调控。方法以11种乳腺癌细胞系为材料，乳腺非致瘤细胞株（MCF-10A）作为参照，分别于RNA水平及蛋白质水平分析MARVELD1内源性表达，并筛选出明显低于MCF-10A的乳腺细胞系。经去甲基化诱导剂与组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理后，检测MARVELD1的表达水平变化。结果MARVELD1基因于12种乳腺细胞系内源性表达，其中SK-BR-3中的MARVELD1表达明显低于非致瘤乳腺上皮细胞MCF10A；去甲基化诱导剂5-Aza-CdR处理SK-BR-3后，MARVELD1基因表达明显升高。结论MARVELD1的基因表达可能受启动子甲基化与组蛋白乙酰化的调控。

【关键词】抑癌基因乳腺细胞系表达遗传学调控

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）36-0034-02

恶性肿瘤已成为仅次于心脑血管病的威胁人类健康的第2大疾病，其发病率及死亡率一直居高不下。乳腺癌为一种发生于乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种严重影响女性身心健康甚至危及生命的最常见恶性肿瘤之一。虽然我国是乳腺癌低发区，但近年来其发病率逐渐增加，特别系京津沪及沿海地区是我国乳腺癌高发区，且呈年轻化趋势，严重地危害着我国广大女性的身心健康。MARVELD1为癌症发生与转移分子机制探讨过程中获取的新候选抑癌基因[1-2]，本文旨在阐明MARVELD1表遗传调控机制以及为MARVELD1基因抑癌机制提供一定的理论依据，以望为治疗乳腺癌的提供一种新方法。

1材料与方法

1.1材料

共采用1种乳腺非致瘤细胞系与11种乳腺癌细胞系，见表1。

表1所采用的各种细胞系

1.2引物

MARVELD1PCR引物：①M1/F:5′-GAGGAAGTAGATTGCTGCCTCTAG-3′；②M1/R:5′-GAGAGCGGTCGGTGTGACCAGCTCTG-3′。GAPDHPCR引物：①Ref/F:5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3′②Ref/R:5′-GGATGATGTTCTGGAGAGCC-3′

1.3实验试剂

RNA提取试剂（TrizolReagent，Invitrogen）；Biospin胶回收试剂盒；HighcapacitycDNAReverseTranscriptionKit逆转录试剂盒（ABIAppliedBiosystems公司）。

1.2方法

1.2.1在乳腺细胞系的表达分析[3-4]

建立扩增标准曲线，首先MARVELD1和内参GAPDH的PCR产物，采用Biospin胶回收试剂盒切胶回收其PCR产物，并测定产物的浓度，以连续10倍稀释为标准曲线模板。材料为所提取的12种乳腺细胞系RNA，模板为2μgRNA，采用逆转录试剂盒进行逆转录，稀释逆转录产物5倍，其作为实时定量PCR待测模板，采用实时定量PCR仪（ABI7500）进行检测。

1.2.2在乳腺癌细胞系SK-BR-3中的遗传学调控分析[5-7]

培养SK-BR-3细胞1天后行5-Aza-CdR去甲基化处理，设置不同的时间与药物剂量梯度，分别用1.0、5.0μM去甲基化诱导剂5-Aza-CdR处理SK-BR-3细胞1天和2天，阴性对照为未加药的SK-BR-3细胞，每天换液1次，采用Trizol试剂提取不同浓度、不同时间5-Aza-CdR处理的SK-BR-3细胞RNA，采用紫外分光光度计检测，以1%琼脂糖凝胶电泳。

以获得的不同浓度、不同时间5-Aza-CdR处理后SK-BR-3细胞RNA作为材料，模板为2μgRNA，逆转录，稀释逆转录产物5倍作为实时定量PCR待测模板。

获取MARVELD1经5-Aza-CdR处理后RNA水平的表达变化后，进一步研究探讨该基因于蛋白质水平变化，取不同剂量不同时间处理后的SK-BR-3细胞，采用WesternBlot实验，内参为GAPDH。

2结果

2.1在乳腺细胞系的表达分析

本实验分析了内参GAPDH标准曲线、扩增曲线与溶解曲线，标准曲线R2=0.994623，其满足了实验的要求，且不同的乳腺细胞系内参GAPDH的扩增样品点都在标准曲线上，说明标准曲线能够用于后续分析。溶解曲线聚集成单峰，基本重叠，内参GAPDH基单一片段扩增，因此无杂带，扩增曲线平滑：指数增长期、基线期、线形增长期与平台期完整，表示每次循环均为荧光激发量实时积累，实时定量PCR获取的数据结果真实、可信度高。

分析目的基因MARVELD1标准曲线、扩增曲线与溶解曲线，标准曲线R2=0.9988133，其满足了实验要求，同时不同乳腺细胞系目的基因MARVELD1的扩增样品点都在标准曲线上，显示实时定量PCR的数据结果真实、可靠。

分析所获取的实时定量PCR数据，结果可示MARVELD1基因在RNA水平上于各乳腺细胞系中表达情况具有差异，其中HS578T、Bcap37、MCF-7均比非致瘤细胞株MCF-10A高，MDA-MB-231、BT549、MDA-MB-435S仅稍比MCF-10A低，而SK-BR-3、MDA-MB-453则明显比MCF-10A低，且SK-BR-3的表达最低。所以后续实验中以SK-BR-3为材料研究MARVELD1的表遗传调控机制。

2.2在乳腺癌细胞系SK-BR-3中的遗传学调控分析

本实验提取的药物处理组SK-BR-3的总RNA较完整，且无DNA污染，完全满足后续的实验要求，见图1。在此基础上采用NanoDrop2000c（Thermo）超微量分光光度计测定溶液OD260/OD280吸光度值与RNA浓度，重复3次，结果所示提取的RNAOD260/OD280比值均>1.8，故可用在后续实验中。

采用ABI7500实时定量PCR仪检测，内参为GAPDH，扩增曲线可示效果良好，能用于下步数据分析。

采用5-Aza-CdR去甲基化诱导剂处理SK-BR-3细胞后，MARVELD1的蛋白表达表现出不同程度的升高，其中以5-Aza-CdR1.0μM处理2天的细胞中表达量最高，而经5-Aza-CdR1.0μM处理的细胞中MARVELD1表达量稍比经5-Aza-CdR5.0μM处理的细胞高，但升高程度无RNA水平显著，其主要是因MARVELD1于蛋白的表达水平中可能还存在其它调控机制，进而使RNA与蛋白质水平未出现一致的改变趋势。

注：从左往右为空白对照、1.0μM处理1天、5.0μM处理1天、1.0μM处理2天、5.0μM处理2天。

图1不同浓度、时间5-Aza-CdR处理SK-BR-3细胞的RNA电泳图

3结论

本实验主要以乳腺癌细胞系SK-BR-3作为材料，行去甲基化与乙酰化药物处理来分析MARVELD1的表遗传学调控机制，结果显示MARVELD1的基因表达可能受启动子甲基化与组蛋白乙酰化的调控。

参考文献

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