脂质体的制备技术及研究进展

脂质体的制备技术及研究进展

杨宝1杨四涛1王磊2

杨宝1杨四涛1王磊2(通讯作者)

(1大理州人民医院药剂科云南大理671000；2新疆武警总队卫生队第五支队新疆和田848000)

【摘要】目的综述脂质体的制备方法及其应用的研究进展。方法查阅近几年有关脂质体研究的国内外文献。结果从制备方法和应用方面进行了概括。结论脂质体的制备方法多样，应用广泛。开展脂质体制剂的研究，推进脂质体的工业化具有可能性和现实意义。

【关键词】脂质体制备综述

【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）05-0096-03

脂质体(liposomes)是磷脂分散在水中时形成的一个球状的脂质双分子层，其内部为水相的闭合囊泡。磷脂、三酰甘油类和胆固醇是脂质体的主要成分。由于其结构类似生物膜，故又称人工生物膜(artificialbiologicalmembrane)，因此被认为具有高度的生物相容性[1]。脂质体作为药物载体，具有以下优点：脂质体既能包封脂溶性药物，又能包封水溶性药物；脂质体能有效地保护包裹物；能有效地控制药物释放；可通过改变脂质体大小和电荷，以控制药物在体内组织中的分布及在血液中的清除率；改变脂质体某种物理因素，例如改变用药局部的pH、病变部位的温度等能明显改变脂质体膜的通透性，促使脂质体选择性地释放药物；可用单克隆抗体等配体修饰脂质体，靶向病变部位(即药物导弹)；脂质体进入体内后主要被网状内皮系统中吞噬细胞所吞噬，这能激发机体的自身免疫功能，并使药物主要分布在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中，从而提高药物的治疗指数；脂质体本身对人体无毒性和免疫抑制作用；脂质体适合多途径给药等。自从1965年英国科学家AlecBangham在研究血液中的脂质成分时发现脂质体以来，脂质体作为一种药物给药载体在医药领域的研究得到国内外的广泛关注，并取得令人瞩目的成就，到目前为止SFDA已批准了多柔比星、阿糖胞苷、两性霉素B、紫杉醇等多个相关脂质体产品在中国的上市，奥沙利铂、长春瑞滨等多个脂质体产品申报上市也在进行中。本文着重介绍脂质体作用特点、制备方法、处方设计的研究进展。

1脂质体的作用特点

脂质体由于独特的结构特征，作为药物载体，使它具有许多作用特点。如靶向性、长效作用、逆转肿瘤耐药性、改变药物的药代动力学性质和组织分布等。

1.1脂质体的靶向性

靶向性是脂质体作为药物载体最突出的特点。根据脂质体产生靶向的机制，可分为被动靶向、物理化学靶向和主动靶向。现将进行简要归类如下：

1.1.1天然靶向性是指一般脂质体进入体内主要被网状内皮系统的吞噬细胞摄取，使脂质体主要分布在肝、脾和骨髓等网状内皮细胞较丰富的器官中，对这些器官具有天然靶向的性质。脂质体广泛用于肝肿瘤等的治疗和防止淋巴系统肿瘤等的扩散和转移。例如Tardi[2]等将脂质体包载多柔比星后，药物主要集中在肝和脾组织中，大大降低了药物对心脏的毒副作用。脂质体不仅是肿瘤化疗药物的理想载体，也是疫苗、寡核苷酸、质粒DNA的理想载体[3]。

1.1.2物理化学靶向性物理化学靶向性是在脂质体的设计中，应用某种物理化学因素的改变，例如用药局部的pH、病变部位的温度等的改变而引起脂质体膜的通透性改变，从而造成脂质体选择性地释放药物。目前利用物理靶向性设计的温度敏感脂质体(temperaturesensitiveliposome)是脂质体物理靶向性较为成功的例子。温度敏感性脂质体在相变温度时，脂质体的磷脂膜产生从胶晶态过渡到液晶态的物理转变，使包封药物快速释放。从而提高局部药物浓度，起到靶向的作用。当温度敏感脂质体进入体内毛细血管床时，脂质体发生相变，同时在某种血浆成分(主要是脂蛋白)作用下，脂质体迅速完全地释放药物，扩散后使血管内外的药物浓度达到平衡。例如Kono[4]等对多柔比星温度敏感性脂质体进行制备和研究，发现在温度高于40℃时引起脂质体相变，促使脂质体内部包封的多柔比星释放，达到靶向性的目的。另外，人和某些动物的肿瘤间质液的pH比正常组织低，某些包封有弱离子性药物的脂质体，在进入体内后，可以选择性地在肿瘤的低pH局部释放药物。这种受pH影响释放药物的脂质体称为pH敏感脂质体(pHsensitiveliposome)[5,6]。此外磁性脂质体[7]，即让脂质体包裹极细的磁铁粉和药物，通过病灶组织器官施加磁场，使得脂质体靶向于病灶，则为脂质体靶向性开辟了一条新的途径。

1.1.3配体专一靶向性在某种脂质体上连接一种识别分子，通过配体分子的特异性专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用而使脂质体在靶器官或靶组织释放药物。常用于脂质体修饰的配体有：糖脂或糖蛋白、植物凝集素(麦胚凝集素、荆豆凝集素)、叶酸、乙二胺四甲叉膦酸[8]、转铁蛋白[9,10]和其他抗体(如抗HER2[11]、抗CD20[12]、抗CD19[13]、抗体片段Fab[14]和scFv[15])等。连接了不同配体的脂质体，对不同受体细胞具有专一的靶向性。

1.2脂质体的长效作用

脂质体作为药物载体能够发挥其长效的作用是脂质体的另外一个特点。脂质体包封的药物在血循环中保留的时间，多数要比游离药物长得多。脂质体以静脉注射进入体内后被血管内皮网状系统中吞噬细胞处理，缓慢释放药物而发挥缓释长效的功能。

1.3脂质体的逆转肿瘤多药耐药作用

目前多药耐药(MDR)仍然是肿瘤治疗的一主要挑战，获得和固有多药耐药性可在多种肿瘤中发生。多种多耐药机制被研究并进行阐述，这些包括：药物外排泵蛋白(P-糖蛋白)在细胞膜上的过度表达；药物内吞作用的减少；药物的灭活；药物靶向点的改变等。随着对多耐药机理了解深入，越来越多学者把目光投向寻找拮抗或逆转肿瘤细胞多耐药性，早期研究主要集中在小分子逆转剂逆转肿瘤细胞多耐药性，如异博定，环孢霉素A、三氟拉嗪等数种化学增敏剂，即便目前的第二、第三代逆转剂的发现。但此类药物有明显心、肾毒性，故这些逆转剂很少真正应用于临床。近年来人们又转向其他途径寻找逆转肿瘤细胞多耐药性的有效方法。脂质体作为药物传释系统具有靶向释放的特点，其可增加被靶向局部药物浓度，而体液中被包载药物的浓度保持较低，从而减少被包载药物的全身毒副作用，同时也突破抗肿瘤药物的剂量限制这一特性。随着对脂质体及其与细胞相互作用研究深入，一部分学者开始把脂质体应用于肿瘤多耐药的逆转，而且也取得了较好效果，使其在化疗中受到越来越多的重视。Albrecht等[16]在术前30分钟内以2mg/kg的剂量给肿瘤患者注射阿霉素脂质体后，分别在12-50小时内通过外科手术取出肿瘤组织及其周边组织，测定阿霉素在肿瘤及周边区的药物浓度，结果表明阿霉素在肿瘤及周边区的浓度明显大于正常组织。

1.4脂质体改变药物药代动力学性质和组织分布的作用

脂质体作为一种新剂型，它能明显的改变药物的药代动力学和组织分布性质。仝新勇[17]等人制备了紫杉醇前体脂质体(PSAP)在并进行大鼠体内的组织分布进行研究，并与市售紫杉醇注射液(Taxol)的组织分布特征进行了比较发现PSAP与Taxol组相比，肝、脾、卵巢、子宫中的药物分布明显高于Taxol组(P<0.05)，在以上各组织中的相对摄取率(re)大于1；肺、肾中的分布与Taxol组无明显差异(P>0.05)，而在心脏中的分布明显低于Taxol组(P<0.05)。王金萍[18]等人制备了洛莫司汀脂质体，并对其静脉注射后新西兰兔的药代动力学和组织分布研究，发现脂质体组的血浆消除相半衰期(t1/2β)为6.05h与溶液组的消除相半衰期2.20h比相显著增加，血浆药物-时间曲线面积AUC(0–∞)是溶液对照组的2.2倍。洛莫司汀脂质体在小鼠脑组织中的药物-时间曲线面积(AUC)、相对摄取率(Te)和靶向效率(Re)也得到明显提高。脂质体改变药代动力学和组织分布的特性越来越受到研究者的重视，并得到广泛地应用。

2脂质体的制备

2.1脂质体的制备材料

脂质体主要是由磷脂及其他附加剂组成，磷脂在脂质体中形成双分子层，其他附加剂如胆固醇等则起到提高脂质体的稳定性或提高脂质体的靶向性等作用。

2.1.1卵磷脂、中性磷脂和负电荷磷脂

磷脂是构成脂质体的主要化学成分，磷脂为两性物质，含有亲水及亲油基团。结构简式中常用的磷脂R为C12-C18不同长度和不同饱和度的脂肪酸链，包括一些饱和脂肪酸，如月桂基(C12)、肉豆蔻酰基(C14)、棕榈酰基(C16)及硬脂酰基(C18)和一些不饱和脂肪酸，如棕榈油酰基(C16)、油酰基(C18)、亚油酰基(C18)。X部分指一个含羟基的含氮化合物，如胆碱、乙醇胺等。脂质体制备材料磷脂中最具代表性的是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)，亦称卵磷脂，PC是构成许多细胞膜的主要磷脂成分，与其他磷脂相比，它的价格相对较低，化学性质也较稳定是制备脂质体的理想的原料。除了磷脂酰胆碱外脂质双分子膜也可由其他中性磷脂如神经鞘磷脂(spingomyelin,SM)或烷基醚卵磷脂、及磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)等组成，SM组成的双分子膜排列较致密，物质不易渗透，膜的流动性也相对较低，因此比卵磷脂膜更稳定。负电荷磷脂又称酸性磷脂，负电荷磷脂是使负电荷脂质体带负电荷主要原因，如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)，磷脂酸(phosphatidicacid,PA)，二棕榈酰甘油磷脂(dipalmitoylphosphatidylglycerol,DPPG)，二肉豆蔻酰甘油磷脂(dimyristoylphosphatidylglycerol,DMPG)，及二硬脂酰甘油磷脂(distearoylphosphatidylglycerol,DSPG)等。

2.1.2胆固醇

胆固醇也是脂质体膜主要成分，胆固醇分子也为两性，其亲油性大于亲水性。胆固醇在脂质体制备中能提高脂质体的膜的稳定性和降低磷脂分子的流动性。胆固醇降低磷脂分子之间的相对移动，从而使脂质体膜稳定性提高。

2.1.3非磷脂脂质材料

苄泽(brij)是由micro-vesicularsystem(MVS)公司于1989年发明了一种脂质表面活性剂材料，其主要成分为聚氧乙烯脂肪醇醚类，它作为非磷脂脂质体被研究者应用。D-α生育酚聚乙二醇琥珀酸甘醇酯(D-alpha-tocopherylpolyethyleneglycolsuccinate,TPGS)是一种最新的脂质体材料，近几年来辅料及其脂质体技术的发展，TPGS在脂质体成膜材料中引起研究者们的广泛地关注。

2.1.4其他赋加剂及其脂质体修饰分子

十八胺是一种用于脂质体电荷修饰材料通过修饰使得脂质体带正电；采用PEG对磷脂进行修饰使得脂质体具有躲避内皮网状系统的摄取，实现长循环的特点；采用单克隆抗体、靶向性分子对脂质体修饰可实现脂质体主动靶向性。

2.2脂质体的制备方法

脂质体制备的关键是使磷脂膜形成均匀的脂质体，并达到需要的大小及形成适合的结构，使被包裹物质具有较高的包封率且不易从脂质体中渗漏。目前，脂质体的制备技术日趋成熟，这里将常用和重要的方法分述如下：

2.2.1以薄膜分散法为基础的制备方法

薄膜分散法薄膜法是脂质体最早被应用也是至今仍常用的技术方法。其制备方法简要如下：将磷脂等成膜材料溶于适量的氯仿或其他有机溶剂，脂溶性药物可加在有机溶剂中，然后在减压旋转下除去溶剂，使脂质在器壁形成脂质干薄膜，加入含有水溶性的缓冲液(或药物水溶性缓冲液)，进行振摇，则可形成大多层脂质体(largemultilamellar，粒径1-5μm)。然后再用各种物理方法(超声分散、挤压分散、高压均质分散等)将大多层脂质体分散成各种小单层脂质体(smallunilamellar，粒径0.25-1μm)。

薄膜分散-超声分散将薄膜法制成的大多层脂质体用超声仪超声处理，根据超声时间的长短可获得不同的粒径的小单层脂质体。

薄膜分散-挤压分散该种方法是在一定压力下使薄膜分散制备的大多层脂质体再通过一具有很小孔径的过滤膜，以获得大小均一的单层脂质体。脂质体挤出过程比较简单，只要将脂质体悬液加入，必要时搅拌，在一定压力下挤压过膜即得。脂质体通过一定孔径滤膜的速率取决于脂质体的大小及浓度、膜中胆固醇含量及所用磷脂的饱和度。脂质体越小、流动性越好越易通过。

薄膜分散-均质分散法将大多层脂质体经过组织捣碎机或高压乳匀机匀化成较小粒径的脂质体。

2.2.2注入法

按溶解类脂所用的溶剂不同可分为乙醇注入法和乙醚注入法。

乙醇注入法将磷脂的乙醇溶液在适宜的温度下，采用微量注射器或微量输液器以适当的速度注入含药缓冲液中，在高速搅拌下，即可形成脂质体。再以透析法除去未包入药物及残余乙醇。该法特点是操作过程迅速、重现性好，但包裹药物百分率不高。

乙醚注入法以乙醚为溶剂制备方法，其制备过程和乙醇注入法相类似。优点是类脂质在乙醚中的浓度不影响脂质体大小。缺点是使用有机溶剂和高温，会使大分子物质变性和对热敏感物质灭活，脂质体粒度不均匀。

2.2.3逆相蒸发法

逆相蒸发法(reverse-phaseevaporationvesiclemethod，REV)将溶有磷脂脂质的氯仿(乙醚等)有机溶剂，加入到待包封药物的水溶液，通过探头式超声进行短时超声，形成稳定的W/O乳剂。然后旋转蒸发仪除去有机溶剂，达到胶态后，再加如缓冲液，在减压下继续蒸发，直到制得水性混悬液。通过凝胶柱层析或透析袋透析。除去未包入的药物，即得到大单层脂质体。大单室脂质体可以通过超声分散、挤压分散、高压均质分散制备得到各种小单层脂质体。此法适用于大部分磷脂的混合物，包封容积和包封率都很高。

2.2.4熔融法

熔融法是将磷脂及表面活性剂加少量水相溶解，胆固醇熔融后与之混合，然后滴入65℃左右的水相中保温，高速搅拌，待形成脂质体后过滤，灌封，灭菌。由于该法不使用有机溶剂，比较适合工业化生产。

2.2.5复乳法

复乳法是指先将少量的缓冲液与多量的含磷脂的有机溶剂进行第一次乳化，形成W/O型反向胶团，减压除去一部分溶剂或完全不除去溶剂，然后加入较大量的缓冲液进行第二次乳化，形成W/O/W的复乳系统。减压蒸发除去有机溶剂后，即形成中等大小的脂质体。

2.2.6pH、醋酸、硫酸铵梯度法

pH(醋酸、硫酸铵)梯度法是指调节通过不同的pH(醋酸、硫酸铵浓度)形成pH(醋酸、硫酸铵浓度)梯度，以主动包封药物的载药脂质体制备方法。例如双氯酚酸脂质体[19]和硫酸卷曲霉素脂质体[20]。

2.2.7其他方法

除此之外脂质体的制备方法还有冷冻干燥法、冻融法、前体脂质体法等。

3脂质体制备的关键问题

脂质体制备涉及的三个最为关键步骤是磷脂的水化、脂质体粒度的控制、及药物的装载。

首先磷脂的水化使得磷脂分子发生重新定向排列，形成磷脂双分子层，而对磷脂来说磷脂水化并且在适宜条件下闭合形成脂质体，控制水化条件显得非常重要。通常来说磷脂的水化是在相转变温度之上完成，对于不同磷脂相转变温度不一样，磷脂酰胆碱的相转变温度在零度左右，而饱和的磷脂DSPC相变温度在55℃左右。制备过程中通过控制不同温度从而达到不同磷脂材料的水化。此外由于磷脂的水化后在磷脂的头部会形成水化成和电离层。缓冲溶液的离子种类、浓度以及pH会对磷脂头部的电离层产生影响，从而影响到磷脂水化和脂质体的荷电行为和整体体系的稳定性，在制剂制备中缓冲溶液的离子种类、离子强度和体系的pH直接影响到脂质体的制备。

其次脂质体的粒度控制对脂质体来说显得格外的重要。不同的制备方法和工艺，得到的粒度也不尽相同。脂质体的粒径大小将影响脂质体在体内的处置。如果将载药脂质体制备成微米，脂质体可作为药物储库，药物更好的发挥缓释作用。对抗肿瘤药物来说如果将载药的脂质体制备成200nm左右，更好的趋向于病灶部位。因此对脂质体来说可以通过临床前药理学和毒理学研究，选择制备最佳粒度范围，实现不同药物的治疗。

此外脂质体的对药物的装载是脂质体制备的关键问题。选择合适的脂质体制备方法和处方，以便获得高的包封率和高的载药量，同时确保载药脂质体在贮存期内稳定而不至于出现药物的渗漏是制备的关键。对于水溶性的药物来说，药物可以通过复乳法等方法先将药物分布到内水相中从而实现对药物较好的包封，而对脂溶性好的药物来说，一般的被动载药可以实现脂质体对药物较好的包封效率，但药物的载药量不是很大。因此根据不同药物的理化性质和期望的治疗目的，使用合适的制备方法来制备脂质体。

脂质体制备的关键问题除了以上论述的几个问题外，还有其他的问题比如如何控制制剂中的有机溶剂残余、防止脂质体磷脂氧化、保证制剂无菌、放大实验室工艺到生产。这些问题都是不可忽视的问题。

4展望

脂质体作为药物的载体，它能控制药物释放，提高了药物的有效性、安全性和稳定性。通过表面修饰的纳米混悬剂还可实现主动靶向给药。脂质体本身对人体无毒性和生物相容性它在在许多疾病，尤其在癌症治疗逆转肿瘤细胞多耐药性中显示出明显的优越性。近年随着人们对脂质体研究的不断深入，必将有更多的稳定性好的脂质体投入临床使用。

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