超声波-微波辅助提取构树叶总黄酮的条件优化及其抗肿瘤活性研究

超声波-微波辅助提取构树叶总黄酮的条件优化及其抗肿瘤活性研究

刘建楠朱开梅

刘建楠朱开梅（桂林医学院药学院广西桂林541004）

【摘要】目的优选构树叶总黄酮的提取工艺条件及构树叶总黄酮抗肿瘤生物活性的研究。方法通过单因素实验考察超声波时间、超声波温度、超声波功率等级对构树叶总黄酮提取得率的影响。通过紫外分光光度计测定总黄酮含量。利用MTT法检测构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响。通过光学显微镜观察经药物处理48h后人肝癌HepG-2细胞的形态学变化。结果超声波辅助提取的最佳条件：超声波时间40min，超声波功率等级为80%，超声波温度为50°。12mg/ml构树叶总黄酮作用肝癌细胞72小时，抑制率可达64.53%。经倒置显微镜观察，可见肝癌细胞发生凋亡现象。结论本工艺采用超声法对药材进行微波法提取前处理，可以极大提高构树叶总黄酮的得率，该工艺操作简单，节能环保，可适用于大规模生产；构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞的增殖有抑制作用，并呈现剂量依赖性和时间依赖性。

构树又称楮树是桑科构树属落叶乔木，广泛分布于我国的温带，该树种具有生长迅速，适应性强，易繁殖等特点。构树不仅是我国宝贵的园林资源，也是重要的药用资源，构树叶、果实、根、茎都可入药。构树叶又称楮叶，能清热利湿，止凉止血的功效，在《本草纲目》中也曾记载“去风湿肿胀……，癣疮”。[12]随着天然药物化学、药物分析、药理学的发展，国内外学者发现构树属提取物具有抗菌、抗毒、抗氧化等做作用，并分离出有效作用成分是黄酮类和生物碱类。本实验在微波辅助提取法研究的基础上，运用超声-微波辅助提取法对构树叶总黄酮提取工艺研究，旨在为构树叶资源的开发利用提供一定的工艺参考，也为天然药物抗肿瘤的研制提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1实验材料与试剂

实验所用构树叶采集于桂林医学院药用植物园，由药学院天然药化教研室傅鹏博士鉴定，将采集构树叶在自然光照下晒干，粉碎后筛取80目粉末，贮存玻璃干燥器中；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供）；实验所用水为蒸馏水；乙醇、氯仿、等试剂均为分析纯；MTT(噻唑蓝，Amresco公司，批号0793)、小牛血清（杭州四季青生物公司）、DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司）、胰酶粉（上海佳和生物公司）。

1.1.2仪器与设备

NJL07-3型实验室专用微波炉（南京杰全微波设备有限公司）；液晶智能超声波清洗机（深圳市威固特科技有限公司）；722型可见分光光度计（上海精密科技有限公司）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义市峪予华仪器厂）；酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）；贺利氏二氧化碳培养箱（ThermoFisher）。

2方法

2.1标准曲线制备

精密称取对照品溶液0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5ml芦丁对照品溶液分别置于10ml的容量瓶中，用无水乙醇定容至5ml，加入5%的NaNO2溶液0.3ml混匀，静置5min，加入Al(NO3)3溶液0.3ml混匀，静置6min，加1mol/LNaOH2.0ml再加无水乙醇定容至10ml，静置15min，于510nm测定其吸光度。得回归方程：A=0.2886x+0.0215（R2=0.9980）

（C为样品溶液质量浓度mg•mL-1;V样品溶液体积mL;W样品质量g）

2.2超声波-微波辅助提取构树叶总黄酮[3-5]

称取干燥构树叶粉末20.0g按照1:10比例加入60%乙醇，浸泡30min后分别在不同的超声波时间、超声波温度、超声波等级进行超声波处理，处理后于微波功率350W，微波温度45°进行微波辅助提取15min，静置常温，过滤，回收乙醇至无醇味。将浓缩液倒入预先处理过的聚酰胺柱内，静置1h，用蒸馏水洗至无色，用70%乙醇洗脱，收集滤液50ml，待测。

2.3MTT法

将对数生长期HepG-2细胞调整浓度为4.5×104个/ml，加入96孔培养板内，每孔100μl，再加入培养基80μl。倒置显微镜观察细胞贴壁后，加入阳性对照组顺铂10μg/ml，实验组加入不同浓度的构树叶总黄酮20μl，使其终浓度为6mg/ml，9mg/ml，12mg/ml，再置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24，48,72h。终止培养后每孔加入20μlMTT溶液，37℃培养箱中继续培养四小时。弃掉上清液，PBS冲洗三次，加入150μlDMSO，振荡，充分溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定490nm处各孔的吸光度。计算细胞存活率。

抑制率（%）=（对照组-实验组）/对照组×100%

2.4光镜显微镜观察细胞形态改变

调整肝癌HepG-2细胞株浓度为8×105个/ml，加入培养瓶内，每瓶1ml，再加入培养基2ml。倒置显微镜观察细胞贴壁后，加入阳性对照组顺铂终使浓度为10μg/ml，实验组加入不同浓度的构树叶总黄酮使其终浓度为6mg/ml，9mg/ml，12mg/ml，再置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养72h。终止培养，PBS冲洗三次，每次3min，更换新鲜培养基，放置倒置显微镜下观察细胞贴壁生长情况以及细胞形态变化。

实验数据均用SPSS15.0统计软件进行One-wayANOVA(单因素方差分析)检验分析。

3结果

3.1超声波时间对构树叶总黄酮提取的影响

超声波时间对构树叶总黄酮提取率的影响见图1。随着超声波时间的延长，构树叶总黄酮的提取率也逐渐增加，当超声波时间到达40min时，构树叶总黄酮的提取率基本稳定，达155.63mg/100g。当超声波时间继续增加达50min时，构树叶总黄酮的提取率明显降低，分析，可能由于长时间的震动，随之出来许多非酮类物质而影响构树叶总黄酮的提取率。故选用超声波40min为最佳超声波时间。

3.2超声波温度对构树叶总黄酮提取的影响

超声波温度对构树叶总黄酮提取率的影响见图2。构树叶总黄酮的提取率随着超声波温度随着温度升高呈现出先升高后降低的趋势。温度升高，分子运动速度加快，黄酮类物质更容易到达溶质中，超声波温度达50°时，构树叶总黄酮的提取率达148.81mg/100g。当温度超过60°时，构树叶总黄酮得率下降，可能是由于过高的温度破坏了黄酮母核结构。故选用超声波温度为50°为最佳超声波时间。

3.3超声波功率等级对构树叶总黄酮提取的影响

超声波等级对构树叶总黄酮提取率的影响见图3。当超声波功率等级达80%时，构树叶总黄酮提取率已稳定达187.53mg/100g，超声波在液态介质中传播可产生空化效应，利于构树叶总黄酮成分的浸出提取。故选用超声波功率等级为80%为最佳超声波时间。

3.4构树叶总黄酮对HepG-2细胞的增殖抑制作用

不同浓度的构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞株均有不同的抑制作用，随着构树叶总黄酮浓度的升高和作用时间的延长，其对对人肝癌HepG-2细胞株的抑制作用越来越显著。如表所示，在作用72h后，9～12mg/ml浓度内对HepG-2抑制作用最为明显，经单因素方差分析，与对照组比较差异具有显著性（P<0.01）,组间比较具有统计学意义（P<0.05）。

表1：构树叶总黄酮对HepG-2细胞增殖的影响

注意：与对照组比较*P<0.05**P<0.01

3.5倒置显微镜观察构树叶总黄酮对肝癌HepG-2细胞形态学影响

倒置显微镜下可见，对照组HepG-2细胞，贴壁生长良好，细胞排列紧密边界清楚，细胞呈现星形或梭形，细胞核大。当药物浓度达12mg/ml时，贴壁细胞数量大大减少，细胞轮廓消失，可见明显的毛刺状。

4结论

1）通过单因素试验研究构树叶总黄酮的超声波-微波辅助提取法的最佳工艺条件为：超声波时间40min，超声波功率等级为80%，超声波温度为50°。2）通过MTT法，发现构树叶总黄酮对人肝癌HepG-2细胞有明显的抑制作用，并呈现出明显的时间依赖性和剂量依赖性。3）通过倒置显微镜观察，发现了细胞有诱导HepG-2凋亡的征象，为构树叶资源进一步开发利用及天然植物抗肿瘤的研制，提供理论依据。

参考文献

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典.2000版一部.北京:化学工业出版社.2000:275

[2]朱开梅,刘建楠,顾生玖等.构树药用活性化学成分及药理临床应用研究进展[J].中国实验方剂学,2011,17(1):198-201,204.

[3]钟方丽,王晓林,杨云涛,薛健飞.超声波辅助法提取玉竹中总黄酮[J].吉林化工学院学报,2012(1):22-25

[4]吴艳芳,王新胜,尹延彦,陈蓉,方方.酶辅助超声波法提取连翘叶总黄酮工艺[J].河南科技大学学报：自然科学版》,2012(1):96-99

[5]张丽珍,周之荣.微波辅助提取野菊花中总黄酮的工艺研究[J]时珍国医国药,2010,21(4):823-825

基金项目：广西科学研究与技术开发计划课题（桂科攻09321056，0815005-1-17）资助；桂林市科技攻关项目(科技攻关20090106-6；20080103-5)。