革兰阴性杆菌产AmpC酶及ESBLs的检测及耐药性

革兰阴性杆菌产AmpC酶及ESBLs的检测及耐药性

刘桂芝

刘桂芝(黑龙江省鹤岗矿业集团肿瘤医院154101）

【中图分类号】R446.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）3-0103-03

为研究ESBLs、产AmpC酶革兰阴性杆菌的耐药状况，我们对158株革兰阴性杆菌进行耐药性分析及产AmpC酶和ESBLs的检测，并将结果报告如下。

一、材料和方法

1材料

1.1菌株来源

2008年10月～2009年12月期间从我院临床标本中分离的至少对一种三代头孢菌素类耐药的部分革兰阴性杆菌。其中包括大肠埃希菌47株，肺炎克雷伯菌38株，鲍曼不动杆菌23株，铜绿假单胞菌15株，阴沟肠杆菌15株，嗜麦芽假单胞菌6株，产气肠杆菌6株、液化沙雷氏菌4株，弗劳第枸橼酸杆菌4株，共158株。

1.2试剂

增菌培养基为M-H肉汤，三维实验培养基为M-H琼脂，头孢西丁(CFX)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶／棒酸(CAZ／CLA)，头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟／棒酸(CTX／CLA)为英国Oxoid公司产品。GNI鉴定卡、GNS药敏卡均购自法国Biomerievx公司，GNS药敏卡包括氨苄青霉素、庆大霉素、环丙沙星、阿莫西林／克拉维酸、头孢噻吩、头孢他啶、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、丁胺卡那、复方新诺明、萘啶酸、头孢噻肟、亚胺培南13种抗菌药物。

1.3质控菌株

质控菌株E．CoilATCC25922，K.PneumoniaeATCC700603，E．Cloacae029M。

2实验方法

2.1菌株鉴定

所有菌株都用VITEK-32分析仪GNI细菌鉴定卡进行菌种鉴定。

2.2体外药物敏感试验

采用GNS检测卡测定13种抗菌药物对158株革兰阴性杆菌的MIC值，操作方法按照VITEK-32规定的方法进行。

2.3产ESBLs菌株检测

2.3.1ESBLs筛选试验方法

158株革兰阴性杆菌经VITEK-32检测MIC值，根据仪器专家系统提示，筛选出产ESBLs菌株。

2.3.2ESBLs确证试验方法

采用纸片扩散确证法，按2004年NCCLS推荐的标准纸片扩散确证法测定ESBLs，采用CAZ(30μg)、CAZ／CLA(30μg/10μg)组合或者CTX(30μg)、CTX／CLA(30μg／10μg)组合，对ESBLs筛选实验阳性菌株进行双纸片协同扩散试验，任一组药物抑菌环的直径差≥5mm时，判定为ESBLs阳性菌株。kPneumoniaeATCC700603作为ESBLs阳性对照，E．Cloacae029M作为阴性对照。

2.4AmpC酶的检测

2.4.1酶粗提物的制备

取单个菌落于4mlM-H培养液中，36℃24h震荡培养，4000r／min，4℃离心，20min，弃上清收集细菌，重悬于1.5ml0.01mol／L(pH7.0)PBS中，反复冻融5次，4℃12000r／min，离心60min，取上清-20℃保存。

2.4.2AmpC酶鉴定实验

取0.5麦氏单位标准菌株E．CoilATCC25922菌液均匀涂布于M-H琼脂平皿，取头孢西丁(CFX)30μg纸片贴于平皿中心，使用无菌刀片在离纸片边缘5mm处放射性由里向外切割一道狭缝，用微量加样器取40μl酶粗提物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将琼脂平皿35℃孵育过夜。若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域，视为三维试验阳性，即AmpC酶阳性。E．Cloacae029M作为持续高产AmpC酶阳性对照，KPneumoniaeATCC700603作为阴性对照。

2.5统计学处理

采用x2检验，P<0.05有显著差异。统计软件为SPSS10.0。

二、结果

1.AmpC酶及ESBLs检出情况

临床分离出的158株革兰阴性杆菌中检测出产ESBLs菌42株，检出率为26.6％，其中大肠埃希菌19株(占45.2％)，肺炎克雷伯菌18株(占42.9％)，阴沟肠杆菌5株(占11.9％)。检出16株细菌产AmpC酶，阳性率为10.1％，其中鲍曼不动杆菌7株(占43.8％)，阴沟肠杆菌4株(占25.0％)，铜绿假单胞菌2株(占12.5％)，大肠埃希菌2株(占12.5％)，产气肠杆菌1株(占6.2％)。

2.158株革兰阴性杆菌的耐药状况

用GNS药敏卡检测13种抗菌药物对158株革兰阴性杆菌的MICs及耐药情况，将中介范围的结果全部归为耐药结果统计，对比临床产ESBLs菌株、产AmpC酶菌株与非产酶菌株的耐药率，结果见表1。

2.1158株革兰阴性杆菌对13种抗生素的药物敏感率从高到低依次为亚胺培南100％、丁胺卡那88.8％、萘啶酸79.3％、阿莫西林／克拉维酸68.3％、哌拉西林／他唑巴坦53.2％、头孢噻肟49.2％、庆大霉素42.5％、环丙沙星38.6％、头孢他啶36.4％、头孢噻吩32.4％、哌拉西林30.8％、复方新诺明25.4％、氨苄青霉素10.6％。

2.2产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株比较产ESBLs菌株对氨苄西林全部耐药，对复方制剂阿莫西林／克拉维酸耐药率为69.5％。对三代头孢菌素耐药率有一定的差异，头孢噻肟的耐药率达96.6％，而头孢他啶的耐药率为48.3％。对氨基糖苷类抗菌素呈现出不同程度的耐药，庆大霉素耐药率为79．3％，丁胺卡那耐药率为24.1％。萘啶酸的耐药率只有25.9％；复方新诺明耐药率为63.8％。经统计学分析，产ESBLs菌株对氨苄青霉素、头孢噻肟、庆大霉素、阿莫西林／克拉维酸的耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.01)。

2.3细菌产AmpC酶与细菌耐药情况的相关分析

对产AmpC酶的菌株的耐药率较高的抗生素有：氨苄青霉素98.6％，头孢他啶95.2％、哌拉西林92.3％、头孢噻肟86.5％，而对不产AmpC酶的菌株的耐药率较高的抗生素有氨苄青霉素84.6％，庆大霉素56.4％、哌拉西林50．6％、头孢噻肟42.6％。研究得出庆大霉素(χ2=12.703，P<0.01)、哌拉西林(χ2=13.634，P<0.01)、头孢噻肟(χ2=12.365，P<0.01)，说明革兰阴性杆菌中产AmpC酶的细菌对庆大霉素、哌拉西林、头孢噻肟的耐药性明显增高，与不产AmpC酶的细菌的耐药性有显著性差异。

三、讨论

1．近几年来，革兰阴性杆菌在临床引起的感染日益突出，在多种耐药机制中质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及高水平表达染色体编码的AmpC酶是肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗生素耐药最重要的机制，检出率逐年上升，这已成为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古酶素肠球菌另一医院感染主要致病菌。因此，临床微生物实验室应开展耐药菌监测，快速有效地检测ESBLs及持续高产AmpC了解各类抗生素及其耐药情况，指导临床合理用药。

2．AmpC酶属于Bush分类中的Ⅰ类酶或AmblerC类酶，是一种能水解青霉素类，1、2、3代头孢菌素类和单环类抗生素的β-内酰胺酶，β-内酰胺酶抑制剂不能抑制其水解活性。AmpC酶的产生可分为染色体介导和质粒介导两种，以染色体介导为主。根据AmpC基因表达的不同，可将带有AmpC基因的细菌分为两种表型：持续低水平表达(组成性表达)和持续高水平表达(去阻遏突变)。鉴于目前美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)对AmpC酶的检测尚无统一方法，本实验中我们采用酶粗提物头孢西丁三维实验提取持续高产AmpC酶，对158株革兰阴性杆菌进行检测发现，仅有16株细菌阳性，产AmpC酶的总阳性率为10.1％。由于不同菌属高产AmpC酶的菌株数不同，所以我们只是对产AmpC酶的阳性菌株在革兰阴性杆菌中分布情况的流行病学进行调查，并对调查结果进行初步分析后得知：在革兰阴性杆菌中，产AmpC酶阳性率较高的是阴沟肠杆菌属及不动杆菌属，这一调查结果与国内外学者的研究结果基本一致。

3．持续高产AmpC酶的菌株对抗生素的耐药性极强，它们除了对碳青霉烯类抗生素(如IPM)的敏感性较高外，对大多数抗菌药物均呈耐药状态。我们的研究结果显示：高产AmpC酶的菌株的敏感率为100％，未检出有耐药菌株。产AmpC酶的菌株的耐药率较高的抗生素有：氨苄青霉素98．6％，头孢他啶95．2％、哌拉西林92．3％、头孢噻肟86．5％。应用统计学方法χ2检验对细菌产酶的菌株数及耐药情况的数据进行分析发现：革兰阴性杆菌中产AmpC酶的细菌对氨苄青霉素、头孢他啶、哌拉西林、头孢噻肟的耐药性与不产AmpC酶的细菌的耐药性有显著性差异，说明高产AmpC酶的菌株对广谱青霉素类、三代头孢菌素类及单环β-内酰胺类抗生素高度耐药。治疗持续高产AmpC酶株感染时仍可采用碳青霉烯类如(IMP)。

4．另一方面，细菌产AmpC酶只是产生耐药的机制之一，产ESBLs细菌的耐药性也不容忽视。ESBLs主要见于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等，由质粒介导，从TEM-1、TEM-2和SHV-1的1个或数个氨基酸突变而来。近年来，CTX-M族、OXA族ESBLs也在迅速增加。本研究中ESBLs检出率为26．6％，比AmpC酶稍高。检出的产ESBLs菌主要为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。ESBLs为质粒介导，易在同种属间相互传递，造成医院感染暴发流行，存在地区差异等影响。产ESBLs株通常对三代头孢耐药，部分对四代头孢菌素耐药，但对头霉素类及酶抑制剂复合物及碳青霉烯类敏感。

5．本研究药敏结果显示：两种产酶(AmpC酶，ESBLs)株的耐药性远远高于非产酶株。其耐药率在60％～90％不等，同时对磺胺类，喹诺酮类，氨基糖甘类耐药率在40％～70％之间，显示多重耐药，给临床选药带来较大困难。在药敏结果中，未发现产酶株对亚胺培南耐药，证明亚胺培南为治疗产酶株引起感染的首选用药。在非产酶株中出现3．8％的耐药率，全为嗜麦芽假单胞菌引起，可能该类菌株中存在水解碳青霉烯类金属酶所致。

6．本研究中对产ESBLs和AmpC酶的菌所致感染的病例做了初步分析调查，产酶株多来自于长期住院和入住ICU患者，大多为大量使用过头孢菌素尤其是头孢噻肟、氨曲南、头孢他定、头孢匹肟等，治疗时间一般为7～10天，在抗生素的诱导和压力下，产β-内酰胺酶耐药细菌日益增多。因此，合理使用抗生素非常必要，同时，简便迅速准确地进行ESBLs和AmpC酶的检测，给临床提供针对性用药依据显得更加重要。

7．三维试验是目前公认的较为经典的检测(去阻渴)持续高产AmpC酶的方法，也是目前检测质粒AmpC酶最好的方法。使用NCCLS推荐的ESBLs检测方法，简便快速，适合临床常规检测。建立AmpC酶和ESBLs的检测方法能满足临床，充分掌握细菌耐药特性，及时、准确地检出耐药菌株，对指导临床合理使用抗生素，控制耐药菌株的播散及流行等均有十重要的意义。

参考文献

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