miRNA-210在肾透明细胞癌中的表达和意义

miRNA-210在肾透明细胞癌中的表达和意义

丁雨钦1章伟2

丁雨钦1章伟2

(1浙江省肿瘤医院乳腺外科浙江杭州310022

（2浙江省肿瘤医院泌尿外科浙江杭州310022)

【摘要】目的：探讨血清microRNA-210（miRNA-210）在肾透明细胞癌中的表达和其临床意义。方法：用实时荧光定量PCR技术检测82例肾透明细胞癌患者和55例健康人群的血清miRNA-210的表达水平。结果：与健康人群相比，肾透明细胞癌患者的血清中miRNA-210呈高表达（P＜0.0001）。且不同TNM分期的肾癌患者血清中miRNA-210的表达水平均高于正常人群（P＜0.01）。miRNA-210的血清表达水平在手术后7天明显下降（P＜0.01）。结论：血清miRAN-210在肾透明细胞癌患者中呈高表达状态，可能成为一类新的临床诊断分子标记物。

【关键词】肾透明细胞癌；miRNA；实时荧光定量PCR

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）22-0034-04

MiRNA-210inserumasapotentialdiagnostictoolforrenalclearcellcarcinomaDingYuqin,ZhangWei.

TumorHospitalofZhejiangProvince,ZhejiangProvince,Hangzhou310022,China

【Abstract】ObjectiveTostudymicroRNA-210(miRNA-210)expressioninrenalclearcellcarcinomaanditsclinicalsignificance.MethodsTheexpressionlevelsofserummiRNA-210inrenalclearcellcarcinomapatientsandhealthcontrolswereanalyzedwithRT-PCR,theirrelationshipswithclinicalpathologicalfeatureswereanalyzedwithstatisticalmethod.ResultsComparedwithhealthcontrols,serummiRNA-210werehigh-expressedinrenalclearcellcarcinoma(P﹤0.0001).Besides,Eachofthe3stagespatientshadsignificantlyelevatedserummiR-210levelswhencomparedwiththecontrols(P﹤0.01).ThemeanmiR-210levelwassignificantlyreducedinthepost-operativesamplescomparedtothepreoperativesamples(P﹤0.01).ConclusionmiRNA-210maybeusedaspotentialdiagnosticforrenalclearcellcarcinoma.

【Keywords】Renalclearcellcarcinoma;miRNAs;Quantitativereal-timePCR

肾癌(renalcellcarcinomaRCC)，是继前列腺癌和膀胱癌之后较常见的泌尿系统肿瘤，约占全身恶性肿瘤的3％，其中肾透明细胞癌（Clear-cellRCC,cRCC）是最常见的亚型，约占75～80％[1]。临床主要症状表现为血尿、疼痛和肿块。约40%的患者早期症状不明显，待症状明显时多已晚期，从而延误了最佳治疗时机，死亡率高达40％以上[2]。缺乏有效的早期肾癌诊断标志物是导致肾癌不良预后和高死亡率的重要原因之一。因此在临床诊断治疗过程中急需寻找一种行之有效的诊断标志物，以此提高肾癌患者的早期诊出率并改善疾病预后。

miRNA(microRNA)是一类长度约18～25nt的内源性非编码小RNA，由一段具有发夹样环状结构、长度约70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。在人体内，它通过与靶基因mRNA分子3’UTR区结合，抑制靶基因的翻译，负调控靶基因的蛋白水平[3]。研究表明它在胚胎发育、细胞分化、血管形成、肿瘤发生等许多重要病理生理过程中发挥调控作用[4-9]。在肿瘤方面，研究发现miRNA与肿瘤的发生、转移微环境形成、浸润甚至治疗耐受等有密切关系[10]。

近年来恶性肿瘤相关的miRNA逐渐成为新的分子生物学研究热点，其中有关于肾癌相关的miRNA表达也有研究报道。Huang等[11]分析了肾透明细胞癌癌组织与其癌旁正常组织中miRNA的表达谱，共检测到81个miRNAs，其中48个为肾癌中所特有，与正常癌旁组织对照，17个miRNA低表达，2个miRNA高表达，14个miRNA的表达无差异。Chow等[12]同样研究了肾透明细胞癌组织中miRNA的表达谱，对比正常癌旁组织，，发现33个miRNA表达失调，其中21个miRNA表达上调(miRNA-122，miRNA-210，miRNA-101等)，12个miRNA表达下调(miRNA-200c，miRNA-720，miRNA-150等)。本研究中笔者选取其中一类肾癌相关miRNA（miRNA-210）作为研究对象，通过对临床中符合研究条件的80例透明细胞型肾癌患者进行血液中miRNA-210检测，来发现miRNA-210与透明细胞肾癌的疾病发生率的相关性，进而探究miRNA是否可以成为肾癌甚至其他类型的恶性肿瘤早期诊断的新型生物学标志物。

1.材料和方法

1.1一般资料

选取2010年1月至2015年1月我院收治的82例ccRCC患者作为病例组，临床诊断均符合透明细胞型肾癌的诊断标准，所有患者均采集血液标本，其中患者年龄35～82岁，平均年龄58岁，男性患者32人，女性患者50人。根据临床TNM分期标准，T1期20人（24.4%），T2期32人（39%），T3期30人（36.6%）。全部ccRCC患者中选取10例，在其术前和术后7天分别采集血液标本，用于比较血清miRNA-210的浓度变化。同时选取了55名门诊行肿瘤体检并且最终排除肾癌诊断的健康人群作为对照组，年龄范围20～68岁，平均年龄44.2岁，其中男性20人（56.5%），女性35人（43.5%）。两组人群在年龄、性别以及患者组中TNM分组等方面的差异均无统计学差异（P＞0.05），见下表。

表入组人群一般情况

1.2采集血液样本

本实验中涉及患者及健康人群在提取保留血液样本前均已被明确告知抽取血液用途，并经知情同意。82例实验组血液样本通过静脉采血约3.5ml，置于采血管中，通过离心机4℃条件下1200g的10分钟离心后仔细分离血清层。再将血清样本在4℃条件下10’000g的10分钟离心移除细胞碎片和其它杂质。最终将血清样本保存于-80℃环境中作为后续实验备用。其中10例接受手术治疗的患者分别在手术前以及术后7天经过2次采血。55例健康人群血液标本也采取同样方法进行血清的提取和保存。

1.3RNA提取和反转录

本实验利用德国Qiagen公司的MicroMiniKit试剂盒提取血清样本中总RNA，实验过程严格参照产品说明书。并使用Nanodrop-1000（ThermoScientific）紫外分光光度计测量其浓度。将200ng总RNA样本与5×miScriptRTBuffer4?l、miScriptReverseTranscriptaseMix1?l、RT引物1?l、dNTP混合物0.5?l，RNA酶抑制剂0.25?l共同混合，最后用DEPC水补足20?l制成混合液。将混合液置于以下培育条件进行逆转录：37℃×60min，95℃×5min，后冷却至4℃。并将最终cDNA产物保存至-80℃备用。

1.4RT-PCR

本实验通过SYBRGreen法，利用miScriptSYBRGreenPCR(Qiagen)试剂盒进行real-timePCR定量检测microRNA，按如下体系操作：取1μlcDNA样品，混合12.5μl2×QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix溶液，1μl10×miScript通用引物溶液，1μlof10×miScript配对引物溶液，最后用9.5μlDEPC水补足25μl混合液。将7500Real-TimePCR仪（Biosystems）设置扩增条件：95℃×10min，然后将95℃×15s、56℃×30s，72℃×35s过程进行40个循环，最终将产物放置于-20℃保存。所有实验重复3遍。实验中以miRNA-39作为内参，利用SDS1.4软件计算rt-PCR循环阈值(Ct)，数据采用2-△△Ct法进行分析。

1.5统计学分析

本研究所有数据均应用SPSS13.0建立数据库并进行统计学分析，实验中miRNA表达水平比较利用Mann–WhitneyU检验或Wilcoxon检验法。以上统计学检验以α=0.05作为检验水准，在对照组和多个实验组的多重比较中，经Bonferroni校正，以α=0.01作为检验水准。建立ROC曲线来判断miRNA-210诊断价值。

2.实验结果

2.1RNA样本稳定性检测

在前期预实验中我们通过紫外分光光度计分别测量比较3种处理方式后的RNA浓度：未经-80℃冷藏处理的RNA样本、经冻融处理后得到的RNA样本以及经冻融处理后静置2小时后得到的RNA样本。比较三组RNA样本实验结果数值，发现各组RNA浓度含量无统计学差异（P=0.930），见图1。

图1RNA样本冻融过程对其浓度的影响

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图1：采用箱式图表现3组间RNA浓度差异。Y轴表示经紫外分光光度仪检测的RNA浓度（ng），X轴标出3种RNA不同处理方式。箱式图上下界分别提示各组总数值的25%和75%分位数值，图中横线表示中位数值。统计学方法采用Friedman检测。

2.2各组实验中血清miRNA-210表达水平比较

不同实验组血清中miRNA-39含量作为标准内参，与各组中miRNA-210含量数值标准化后取Log10数值（作为散点图Y轴）进行比较。在比较82例ccRCC患者与55名健康人群的血清miRNA-210含量实验中，明显高于对照组55名健康人群的平均水平1.3E-3±0.8E-3。实验结果提示两组间miRNA-210的表达水平存在统计学差异（P＜0.0001），见图2。我们将所有ccRCC患者按TNM分期系统进行分组：StageⅠ20人，StageⅡ32人，StageⅢ30人。比较不同肿瘤分期组与对照组中的血清miRNA-210表达水平，结果发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期组的cRCC患者血清miRNA-210表达水平均高于正常对照组（P＜0.01），但3组实验组间比较时却无统计学差异，见图3。我们还比较了10例ccRCC患者在术前和术后7天的血清miRNA-210表达水平差异，结果发现患者在术后7天的血清miRNA-210表达平均水平（1.3E-3±0.3E-3）较术前时（9.6E-3±3.2E-3）明显下降（P=0.004），且差异有统计学意义，见图4。

图2cRCC组和对照组间血清miRNA-210表达的比较

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图2：采用散点图分析比较cRCC患者组（n=82）和对照组（n=55）间血清miRNA-210表达差异。Y轴显示miRNA-210浓度值经内参miRNA-39归一化为log10值后数值。cRCC患者组的miRNA-210表达水平（平均值：（13.5E-3±4.6E-3）明显高于对照组水平（平均值：1.3E-3±0.8E-3）(P＜0.001)。统计学方法采用Mann-WhitneyU检验。

图3不同TNM分期的cRCC患者与对照组血清miRNA-210表达差异比较

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图3：采用散点图分析比较不同TNM分期cRCC患者组（I期20例，II期32例，III期30例）和对照组（n=55）间血清miRNA-210表达差异。Y轴显示miRNA-210浓度值经内参miRNA-39归一化为log10值后数值。cRCC各个分期患者血清miRNA-210表达均显著高于对照组（P＜0.01），但各分期组间比较时未见显著差异。统计学方法采用Mann-WhitneyU检验。

图4cRCC患者肾癌根治术前与术后7天的血清miRNA-210表达差异比较。

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图4：采用线图分析比较cRCC患者肾癌根治术前与术后7天的血清miRNA-210表达差异。术后7天的miRNA-210浓度（平均值：9.6E-3±3.2E-3）较术前（平均值：1.3E-3±0.3E-3）显著降低（P=0.004）。统计学方法采用Wilcoxon检验。

3.miRNA-210与ccRCC相关性

根据血清miRNA-210在实验组和对照组中的不同表达水平，我们绘制了miRNA-210的受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲线）。我们通过分析发现：miRNA-210的ROC曲线下面积为0.69（95%可信区间范围：0.60-0.78），与ccRCC相关的特异性50%，敏感性82%，见图5。结果显示miRNA-210和ccRCC具有一定相关性，可作为一类ccRCC的分子诊断工具。

图5cRCC患者血清miRNA-210浓度ROC曲线分析

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图5：血清miRNA-210ROC曲线下面积AUC=0.69（95%可信区间：0.60～0.78），特异性50%，敏感性82%。

4.讨论

既往研究表明，游离于细胞外的核酸片段可存在于各类体液中：如血浆/血清、唾液、尿液甚至乳汁中。其中大多由坏死或凋亡细胞分泌[13-14]，而固态肿瘤多可发生肿瘤细胞的坏死，也是恶性肿瘤患者中可检测高高表达的血清游离miRNA的原因之一。TMatsumura等发现在结肠癌肿瘤患者中，多种血清miRNA存在表达上调，如：miRNA-19、miRNA-23a、miRNA-92a等[15]。Bryant的研究中发现有早前列腺癌患者的血清中有12种miRNA存在异常表达，而其中的miRNA-141和miRNA-375还与肿瘤的浸润相关[16]。通过查阅既往相关文献发现，目前尚无关于肾癌与血清miRNA-210的相关研究。因此笔者认为血清中游离的miRNA也许可成为一类新型的血清肿瘤标志物。

MiRNA-210定位于11号染色体短臂(11p15.5)，属缺氧诱导相关的miRNA。在缺氧环境中高表达并被HIF1调节[17-18]。Chan等利用具有代表性的缺氧细胞类型肺动脉内皮细胞，证明在缺氧环境中高表达的miRNA-210可以作用于靶基因铁原子簇蛋白(ISCU)并参与线粒体电子传递链，参与调节细胞的新陈代谢[19]。Fasanaro等体外实验证实在缺氧的状态下，内皮细胞高表达miRNA-210，miRNA-210可刺激毛细血管样形成、内皮细胞增殖和迁移；转染证实miRNA-210在转录后水平调控靶基因EphrinA3，EphrinA3在心血管系统的发展和血管重建方面起关键作用[20]。Greither也证实miRNA-210能连结EphrinA3的3’端UTR区，抑制miRNA-210的表达能增加EphrinA3的蛋白水平，减少集落细胞存活[21]。大量的研究表明，高表达的miRNA-210在各种肿瘤疾病中作为癌基因发挥重要作用，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等有关。

在本文中我们提取了82例透明细胞型肾癌患者血清中miRNA-210，并用RT-PCR实验方法转录增殖获得稳定含量的miRNA实验样本。为了保证miRNA样本稳定性，我们在实验前期通过miRNA的冻融实验与即时样本（未经冻融处理的miRNA样本）比较，结果发现实验组和对照组之间miRNA含量浓度无明显统计学差异，减少了后期实验中可能存在的人为误差。

本文的实验研究结果证实，透明细胞型肾癌患者血清中的miRNA-210存在高表达现象，今后可能成为肾癌的一类新型血清肿瘤诊断标志物。实验中我们通过比较肾癌患者和正常对照组人群血清中的miRNA-210含量，结果发现实验组血清中miRNA-210含量高于正常对照组人群（P＜0.0001）（图1）。通过该实验结果我们猜测：在肾癌患者血清中的miRNA-210是由肾癌细胞参与分泌的，而且血清中存在的许多RNA酶类似乎对于高浓度miRNA-210没有产生降解。既往有研究证实，存在于血清中的小片段miRNA分子可以结合于某些分子或囊泡中（例如外泌体），我们也将在后续的研究中进一步探究其原因。

我们将82例肾癌患者通过不同特征分类：性别、年龄、肿瘤的TNM分期，通过各组间比较未发现统计学差异（表1）。我们进而将82例血清miRNA样本通过肿瘤病理学分期分为I期、II期、III期患者，分别于正常对照组人群样本比对，希望探究不同分期的透明细胞型肾癌患者血清中的miRNA-210表达含量是否存在差异。结果发现：各个分期的肿瘤血清miRNA-210含量均高于正常对照组（P=0.004，P＜0.001，P＜0.001），但在各分期之间比较时却没有明显差异存在。我们同样比较了10例接受肾癌根治术患者的术前术后血清中miRNA-210的含量变化，结果发现在接受肾癌根治术后7天的患者血清中miRNA-210含量较术前明显降低（P=0.004），这同样证实了我们关于miRNA-210来源于肾癌细胞的猜想。实验中用作内参比较的miRNA-39在术前术后的表达则无明显差异。通过miRNA-210的ROC曲线发现，cRCC患者血清miRNA-210特异性为50%，敏感性为82%（AUC=0.69，95%可信区间范围：0.60～0.78）。说明血清miRNA-210与cRCC存在一定相关性，在临床诊断中可以作为无创的病理学辅助诊断工具。

经相关文献的大量查阅，国内尚无关于透明细胞型肾癌中miRNA-210表达的相关研究。在关于miRNA-210与其他类型恶性肿瘤（如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌）的相关性研究中，人们发现miRNA-210在多种类型恶性肿瘤中均存在的高表达状态[22-23]。此外在关于肾癌的miRNA表达谱研究中发现，多种类型的miRNA出现了高表达，包括miRNA-210[24]。因此笔者认为，通过检测肾癌患者血清中的miRNA-210含量可以帮助诊断早期肾癌，但如联合其它多种miRNA的检测或其它类型临床辅助检查，可进一步提高临床诊断正确率。

5.结论

通过实验笔者发现：miRNA-210可稳定存在于透明细胞型肾癌患者血液中。与正常对照组人群相比，肾癌患者的miRNA-210出现了表达上调，且在手术后7天其表达浓度又可明显下降。因此认为血清miRNA-210可作为透明细胞型肾癌的早期临床辅助诊断工具，并或许将改善患者的总体预后。

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