桑叶活性多糖调整小鼠肠道菌群失调的研究

桑叶活性多糖调整小鼠肠道菌群失调的研究

王菱枝赵骏黄灿叶方圆张霞

王菱枝赵骏(通讯作者)黄灿叶方圆张霞（天津中医药大学300193）

【中图分类号】R378.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）1-0041-03

【摘要】目的研究桑叶活性多糖调整小鼠肠道菌群失调的作用。方法利用气相色谱法检测分析肠道菌群失调小鼠的肠道菌群代谢物中短链脂肪酸的变化，通过盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调模型，给予多糖进行治疗，对小鼠的新鲜粪便进行分析。结果模型组，短链脂肪酸含量显著降低，经多糖治疗后，肠道菌群恢复平衡，短链脂肪酸的含量上升。结论桑叶活性多糖能有效地调控肠道菌群失调。

【关键词】桑叶活性多糖肠道菌群短链脂肪酸

肠道菌群不仅参与肠道的感觉运动功能,而且通过肠道运动清除肠腔内多余的细菌来控制肠道微生态。正常情况下,肠道菌群和宿主、外界环境建立起一个动态的生态平衡,对人体的健康起着重要作用，任何打破其内外环境的举措都可导致菌群的失调，表现为肠道菌群的种类、数量、比例、定位和代谢特征的变化。

短链脂肪酸（SCFA）为肠道菌群发酵的产物，即为肠道代谢物。其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高,肠道代谢物是生命过程中发生的生物化学反应的产物，能够从某种程度上反映生命过程的本质。由于机体的病理变化，代谢产物也产生了某种相应的变化,对这些由疾病引起的代谢产物进行相应的分析，能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径。本实验通过分析肠道菌群失调的小鼠的新鲜粪便中肠道代谢物（短链脂肪酸）变化来研究桑叶活性多糖具有调控小鼠肠道菌群失调的作用。

一、材料

1.实验材料

昆明种全雄小鼠45只，体重20-25g，购于解放军第四研究所；乙酸、丙酸、正丁酸标品；天津市光复精细化工研究所；盐酸林可霉素，天津金耀氨基酸有限公司；乳酶生，桂林南药股份有限公司。

2.主要的仪器设备

气相色谱仪GC6820，日本岛津；电子分析天平，上海天平仪器厂；台式离心机，北京医用离心机厂；涡旋混匀机，其林贝尔仪器制造公司。

3.主要的试剂及溶液的配制

(1)标准品的配制

用移液枪取20ul的标准品乙酸、丙酸、丁酸分别置于25mL容量瓶中，加乙醚定容，及制标准品溶液。

(2)多糖溶液和乳酶生混悬液的配制

精密称取重均分子量为11.7±0.5×104多糖粉末4mg，乳酶生粉末3.25mg，分别加0.6mL生理盐水，得浓度为6.667mg/mL的多糖溶液。和浓度为5.417mg/mL的乳酶生混悬液。

二、实验方法

1.盐酸林可霉素诱导小鼠肠道菌群失调模型的建立

动物采用随机分组方式，正常组6只，造模组38只。造模组以0.30g/ml盐酸林可霉素灌胃，每次0.6ml，每日两次，连续3天。

2．多糖对盐酸林可霉素引起的肠道菌群失调小鼠进行治疗

将造模成功的30只小鼠随机分组三组，多糖组，阳性对照组(乳酶生组)，阴性对照组

多糖组：桑叶多糖溶液0.6mL，阳性对照组：乳酶生混悬液0.6mL，每天2次，治疗7天，阴性对照组、正常对照组自行饮水，治疗期间检测小鼠粪便中短链脂肪酸——乙酸、丙酸、丁酸的含量变化；不断观察小鼠的精神状态的变化，饮食变化，以及体重的变化。

3．短链脂肪酸的测定

(1)样品的处理

称取小鼠粪便0.5g左右置于10mL离心管中，用8mL温水（34°C）溶解，溶解后维持水温浸提15min,之后用涡旋机涡旋15min,然后6000转/分离心20min,取上清液用于乙醚萃取，萃取分3次进行，且乙醚的萃取量分别为3mL、3mL、2mL,集中乙醚层在水浴锅（36°C）上浓缩至0.5mL左右，所得浓缩液过微孔滤膜后取1ul注入气相色谱仪中，进行分析.

(2)气相色谱条件

色谱系统：岛津GC-6820；色谱柱：毛细管柱：30m×0.25mm×0.25um

柱温：程序升温，初始温度60°C,以20°C/min速率升到190°C，保持3min

进样口温度：220°C；检测器温度：250°C；进样量：1ul。

(3)短链脂肪酸的含量测定

采用外标点法进行含量测定。采用SPSS17.0统计软件进行数据统计分析，结果以平均值±标准差表示，并采用独立样本t检验；P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

三、试验结果

1.盐酸林可霉素诱导小鼠肠道菌群失调模型的建立

(1)小鼠表现特征观察

模型组：摄食摄水量下降，体重减轻；大便无太大变化；背毛失去光泽；精神状态下降，不爱活动；易冷，蜷缩于笼中。体重均相应有所下降。正常组:摄食饮水正常，精神状态良好，好动活跃。

(2)短链脂肪酸的含量变化

表1正常组与模型组短链脂肪酸含量检测结果（C：mg/mL,平均值±标准差）。

(3)正常组与模型组气相色谱图

2.桑叶多糖对盐酸林可霉素引起的肠道菌群失调小鼠的治疗作用

(1)小鼠表观特征观察

各治疗组经过7d调整治疗后，多糖组和乳酶生组小鼠摄食量、饮水量逐渐恢复良好，粪便正常，背毛恢复光泽，精神状态良好，运动比较活跃。各治疗组小鼠体重均有一定程度的上升，模型组稍有恢复，效果与治疗组相比欠佳。

(2)短链脂肪酸的含量变化

表2治疗后短链脂肪酸的含量检测结果（C：mg/mL，平均值±标准差）

注:与模型组相比，*P<0.05

四、讨论

1.肠道代谢产物中短链脂肪酸与肠道菌群有着密切的关系，Weaver等研究了35个健康人结肠的内容物，发现乙酸：丙酸：丁酸的比率为60.7:15.8:17.3。SCFA的种类和数量反应了肠道菌群和宿主生理状态等。如果三种酸的比例明显失调，提示机体有病理变化。本实验表明桑叶多糖治疗组恢复情况良好，小鼠粪便中短链脂肪酸的含量明显上升，较阴性对照组有显著性差异（P<0.05），而较阳性对照组无显著性差异（P>0.05）。

2.实验表明小鼠肠道菌群失调模型成功建立，而且实验结果表明桑叶活性多糖具有调控小鼠肠道菌群失调的作用，因此桑叶活性多糖可研发为肠道疾病临床辅助治疗药物。

参考文献

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