三磷酸胞苷二钠诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

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三磷酸胞苷二钠诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

魏书艳1李育臣2王宇3王佩1赵小妹1张学艳1贾战斗1

魏书艳1李育臣2王宇3王佩1赵小妹1张学艳1贾战斗1

1.保定市第一中心医院神经内科河北保定071000;

2.河北医科大学附属第三医院神经内科河北石家庄050051;

3.河北大学基础医学院河北保定071000

基金项目:1、保定市科技局科学技术研究与发展计划项目(06F04-11)2、河北省卫生厅科研基金项目(20090175)。

作者简介:魏书艳(1976-),女,主治医师,主要研究方向:干细胞治疗神经疾病。通讯作者:魏书艳。

【摘要】目的:探讨三磷酸胞苷二钠体外诱导大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化的条件。方法:从大鼠双侧股骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有三磷酸胞苷二钠(MSCs)的培养液对传至3~5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定。结果:CTP浓度为0.2mg/ml时,能够诱导NF、GFAP和NSE阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%、(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P<0.01)。结论:MSCs可通过体外培养并纯化,CTP可以诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化,最佳诱导浓度为0.2mg/ml。

【关键词】骨髓间充质干细胞;诱导;分化;神经元;细胞培养;三磷酸胞苷二钠

【中图分类号】Q95-3【文献标识码】A【文章编号】1008-6455(2011)02-0075-02

充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),具有很强的自我复制和多向分化潜能,可以被诱导分化为骨骼、心肌、肝细胞、神经胶质细胞和神经元等[1~4],是继胚胎干细胞和神经干细胞之后,又一种能在体外分化为神经细胞的干细胞。三磷酸胞苷二钠(cytidinetriphosphate,CTP)是一种核酸类物质,其主要药效成分三磷酸胞苷在体内参与核酸及磷的代谢,促进蛋白质的合成。本研究旨在探讨三磷酸胞苷二钠体外对骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用,在国内首次应用三磷酸胞苷二钠诱导MSCs分化为神经元样细胞,本实验将为MSCs用于细胞移植提供重要的依据。

1材料和方法

1.1主要试剂及仪器:DMEM培养基(Hyclone公司),新生牛血清(fetalbovineserum,FBS),抗人神经丝蛋白(neurofilament,NF),兔抗人神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)多克隆抗体,胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacaidicproteinGFAP)鼠多克隆抗体。倒置显微镜,CO2培养箱。

1.2取材:取SD成年大鼠(由河北医科大学实验动物中心提供),乙醚麻醉处死,取四肢骨骨髓,用5ml注射器抽取1ml肝素(625u/ml)冲洗骨髓腔,收集细胞悬液至离心管。

1.3方法

1.3.1MSCs的分离培养:用5ml注射器抽取1ml肝素(625u/ml)冲洗骨髓腔,收集细胞悬液至离心管,加D-HanK’S液吹打,离心10分钟,加0.83%的NH4CL溶解红细胞,37℃10分钟。再次离心,用D-HanK’S液冲洗3遍,各离心10分钟,弃去上清液,加含20%FBS的DMEM培养基,接种至30ml培养瓶中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中进行原代培养。细胞在达80%融合时进行传代,5-7d传代一次。

1.3.2CTP诱导MSCs向神经细胞分化:取第5代MSCs加含20%FBS的DMEM液调整细胞浓度为5×104/ml,种至24孔板中(内置盖玻片),加CTP的浓度分别为:0.05mg/ml,0.1mg/ml,0.2mg/ml,0.4mg/ml,0.6mg/ml,0.8mg/ml,对照组不加任何诱导剂,诱导时间10天,诱导后分别做免疫组化鉴定。诱导过程中于倒置显微镜下观察细胞生长及分化。

1.3.3免疫组化细胞鉴定:采用SP法进行免疫组化染色。经细胞免疫组化染色后镜下随机光选取视野(200×),每张盖片计数100个细胞,每个指标计数10张盖片,以明显棕色和深棕色细胞计为阳性,淡棕色和浅色细胞计为阴性,计数时只计有明显细胞形态的细胞数目,失去细胞形态的死细胞和细胞碎片不在计数范围之内。计算GFAP、NF、NSE阳性细胞分别占总细胞数的比例,对各组的阳性细胞率进行统计分析,找出最佳诱导浓度。

1.4统计学处理:数据用(x±s)表示,采用MicrosoftExcel作图及SPSS12.0统计软件处理,诱导组与空白对照组间差异比较选用方差分析。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异非常显著。

2结果

MSCs培养和传代MSCs原代培养72h后,细胞已基本贴壁,细胞变大,变形,形态不一,有的呈梭形,多角形,有少量突起,有的呈圆形。以后每3-4d半量换液一次,一般约10d天细胞可达基本融合。刚传代的细胞呈圆形,24h内完全帖壁,形态较均一,呈长梭形或三角形,胞核圆而明显,呈旋涡样生长。传代细胞生长较快,一般5-7d可达融合。

CTP诱导MSCs向神经细胞分化含有不同浓度CTP的诱导剂,对大鼠MSCs进行诱导,10天后免疫细胞化学检测。计算NF、GFAP和NSE阳性细胞在总细胞数中的比例,结果见表1。数据显示阳性细胞比例随CTP浓度增高而增高,到一定浓度后又有所下降,统计分析,在P<0.01的组中选出与空白对照组的阳性细胞率差别最大的组为最适浓度,为0.2mg/ml,这个浓度诱导MSCs的NF、GFAP和NSE阳性表达最多。

3讨论

MSCs来源于中胚层,是全能干细胞分化而来的非造血系,具有很强的自我复制能力及多向分化潜能,可以分化为骨组织、软骨组织、脂肪细胞、肝细胞等[5],除了向同一胚层来源的组织细胞分化外,MSCs还可以向神经组织分化[2,3]。近来研究表明,MSCs在体内外均可以分化为神经元或神经元样细胞。

目前的研究发现MSCs在体内和体外都可分化为神经细胞,但是MSCs在体内分化为神经细胞的比例远远低于体外诱导后分化为神经细胞的比例[6-9],说明这种细胞分化明显的受到周围微环境的影响,所以进行体外诱导是MSCs分化为神经细胞的主要途径,对于MSCs分化为神经细胞的机制目前尚不十分清楚。

目前诱导骨髓见充质干细向神经细胞分化的方法大体分为3类:化学药物诱[10](抗氧化剂)导法,细胞因子诱导法及共培养诱导法[11-12],化学药物诱导法诱导效率较高,但是抗氧化剂有一定的毒性,对细胞的损伤较大。我们的实验用CTP作为诱导剂,使MSCs逐渐发生形态改变,出现神经元的细胞形态.免疫组化结果有约31%的细胞表达NSE,32%的细胞表达NF,还有63%的细胞表达GFAP。我们的研究结果与其他实验小组的报道吻合,证明了MSCs能定向分化为神经元样细胞。

CTP诱导MSCs分化为神经元样细胞的机制,目前还不清楚,CTP对MSCs的促分化作用可能发生在基因水平,我们推测,可能是CTP与细胞表面的特异性受体结合后,将有关信号传至细胞浆或细胞核内,从而发挥细胞调控功能,使细胞表型和分化方向发生改变,从而诱导MSCs分化为神经元样细胞。

尽管我们在实验中确定有特异性神经元和神经胶质细胞标志蛋白的表达,并且具有神经元的形态,但分化细胞能否分泌特定的神经递质、细胞因子、神经营养因子,是否能整合入宿主细胞的神经环路,还有待进一步研究。

参考文献

[1]ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopietictissues[J].Science,1997,276(5309):71~74

[2]WoodburyD,SchwarzEJ,ProckopDJ,etal.Adultratandhumanbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneurons[J].JNeurosciRes,2000,61:364~370

[3]Sanchez-RamosJ.Adultbonemarrowstromalcellsdifferentiateintoneuralcellsinvitro[J].ExpNeurol,2000,164:247~256

[4]DengW,ObrockaM,FisherI,etal.InvitrodifferentiationofhumanmarrowstromalcellsintoearlyprogenitorsofneuralcellsbyconditionsthatincreaseintracellularcyclicAMP[J].BiochemBiophyResCommun,2001,282:148~152

[5]Biabco,RiminucciM,Groothos,etal.Bonemarrowstromalcells:nature、biologyandpotentialapplication[J].StemCell,2001,19:180~192

[6]PittengerF.Whenbodycan’thealhimself.[J].Nature,2001,414

[7]LiY,ChoppM,ChenJ,etal.Intrastriataltransplantatinofbonemarrownonhematopoieticcellsimprovesfunctionalrecoveryafterstrokeinadultmice[J].CereBloodFlow,2000,20(9):1311~1319

[8]ChenJ,LiY,WangL,etal.Therapeuticbenefitofintravenousadministrationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats[J].Stroke,2001,32(4):1005~1011

[9]LiY,ChenJ,WangL,etal.Treatmentofstrokeinratwithintracarotidadministrationofmarrowstromalcells[J].Neurology,2001,56(12):1666~1672

[10]BlackIB,WoodburyD.Adultratandhumanbonemarrowstromalstemcellsdifferentiateintoneurons[J].BloodCellsMolDis,2001,27(3):632-636

[11]KramerBC,WoodburyD,BlackIBetal.Adultratbonemarrowstromalcellsexpressgenesassociatedwithdopamineneurons[J].BiochemBiophysResCommun,2006,343(4):1045-1052

[12]LeiZ,YongdaL,JunM,etal.Cultureandneuraldifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcellsinvitro[J].CellBiolInt.2007:31(9):916-923.Epub2007Feb25