关于子宫内膜癌ECC-1中他莫西芬通过mir-585调节PAX2蛋白表达特点的探讨

关于子宫内膜癌ECC-1中他莫西芬通过mir-585调节PAX2蛋白表达特点的探讨

凤旭苗

（浙江省嘉兴市嘉善县第一人民医院病理科浙江嘉兴314100）

【摘要】目的：探讨子宫内膜癌ECC-1中他莫西芬通过mir-585调节PAX2蛋白表达特点。方法：应用他莫西芬对ECC-I细胞进行刺激，并通过Western印迹对PAX2的蛋白表达变化进行检测。实时定量检测经他莫西芬刺激后的ECC-I当中PAX2蛋白相关的microRNA的表达变化，选择差异明显micmRNA，合成该micmRNA中的mimics并转染至人的ECC-1细胞中，再次应用Western印迹对PAX2蛋白表达影响进行检测。结果：应用他莫西芬对ECC-I细胞进行刺激后，PAX2蛋白的表达水平相比对照组出现中程度的上调。PCR结果则显示在他莫西芬刺激了ECC-l细胞之后，其中mir-181C*、mir-135b*、mir-585、mir-604表达均较对照组出现明显的下调，其中mimics转染至人ECC-I细胞之后，其中转入的mir-585的mimics在ECC-l细胞当中Western印迹对PAX2蛋白的表达检测相较与对照组出现下调。结论：他莫西芬的刺激下可以引起子宫内膜癌ECC-1细胞中PAX2蛋白的表达出现中程度的上调，而在通过抑制mir-585的水平表达减少mir-585对于PAX2mRNA的翻译的抑制，PAX2蛋白表达调节作用中的一部分相关机制。

【关键词】子宫内膜癌ECC-1；他莫西芬；mir-585；PAX2蛋白

【中图分类号】R737.3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2018）13-0101-02

本文通过对子宫内膜癌的ECC-1细胞中，应用他莫西芬对PAX2蛋白表达的相关调节机制进行分析研究[1]，寻找对其中具有调节作用的microRNA分子，具体研究如下文。

1.材料与方法

1.1材料

人子宫内膜癌细胞株ECC-l细胞（北京大学医学部）；活性炭、鼠抗人单克隆β-actin抗体（sigma公司）；反转录酶TurboRT（北京原平皓生物技术有限公司）；2xTapPCR仪（天根生化技术有限公司）；miScriptReverseTranscription试剂盒（QIAGEN公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；兔抗人抗体PAX2、培养基（RP-M11640）与脂质体Li-pofectAMINETM（Invitrogen公司）；辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗（中杉金桥公司）；合成成熟的microRNA（上海吉玛公司）。

1.2方法

活性炭吸附血清当中固醇物质，制备成10%浓度去固醇的胎牛血清RP-M11640的培养液（A液）。培养ECC-1细胞条件：选择25cm细胞培养瓶，填A液5ml并置于孵箱中，同时排除血清当中的可能残留固醇物质对结果干扰。其中对照组培养瓶不填加他莫西芬；研究组培养瓶加入他莫西芬，用量10μmol/L，继续培养48h。并依据操作说明书进行Western的印迹检测。反转录及PCR依据反转录酶TurboRT和2xTapPCR的相关说明书进行。并通过实时定量检测经他莫西芬刺激后的ECC-I当中PAX2蛋白相关的microRNA的表达变化，选择差异明显的micmRNA，合成该micmRNA中的mimics并转染至人的ECC-1细胞中，再次应用Western印迹对PAX2蛋白表达影响进行检测，涉及所有仪器操作均按照各说明书严格规范执行，确保进行准确的PCR扩增、电泳及Western印迹检测。

1.3统计学处理

采用SPSS16.0统计学软件对研究涉及的数据进行统计与分析，对于刺激组及对照组的结果均采用t进行检验，以P＜0.05表示对比差异显著，对比具有统计学上的意义。

2.结果

2.1PAX2蛋白的表达

应用他莫西芬对ECC-I细胞进行刺激后，PAX2蛋白的表达水平相比对照组出现中程度的上调。其中通过Gel-Proanalyzer的分析其中West-eill的印迹条带，结果获得对照组和研究组PAX2/13-aetin灰度值相对比值，其中对照组的相对比值为0.968，研究组1.355，结果显示研究组PAX2上调了接近40%，P＜0.05。RT-PCR结果显示研究组PAX2mRNA水平（1.549）对比对照组约上调了60%，P＜0.05。

2.2实时定量PCR检测

PCR结果则显示在他莫西芬刺激了ECC-l细胞之后，表现特异的micmRNA主要有mir-181C*、mir-135b*、mir-585、mir-604；其中mir-181C*、mir-135b*、mir-585、mir-604表达均较对照组出现明显的下调，P＜0.05。

2.3PAX2蛋白表达水平

将合成的mir-181C*、mir-135b*、mir-585、mir-604及阴性的对照mimics(NC)，分别于ECC-1细胞中转染。其中通过Gel-Proanalyzer的分析各个转染结果的其West-eill的印迹条带，结果获得各个转染结果的PAX2/13-aetin灰度值相对比值，结果显示其中mimics转染至人ECC-I细胞之后，其中转入的mir-585的mimics在ECC-l细胞当中Western印迹对PAX2蛋白的表达检测相较与对照组出现下调。

3.结论

他莫西芬作为一类非类固醇的抗雌激素药[2]。其在不同组织可能会产生相反作用效果，其在于乳腺组织中起到雌激素的拮抗作用，应用此药可使高危女性在患侵袭性乳腺癌的相关风险减小接近50%，而该药在子宫组织中则起到雌激素的模拟作用，会增加女性患子宫内膜癌患病的风险。

通过本研究提示了他莫西芬的刺激下可以引起子宫内膜癌ECC-1细胞中PAX2蛋白的表达出现中程度的上调，而在通过抑制mir-585的水平表达减少mir-585对于PAX2mRNA的翻译的抑制，PAX2蛋白表达调节作用中的一部分相关机制。

【参考文献】

[1]李轶,赵智凝,王涛,等.在子宫内膜癌ECC-1中他莫西芬通过mir-585调节PAX2蛋白表达[J].医学分子生物学杂志,2010,07(4):291-295.

[2]高敏,曹远奎,魏丽惠,等.孕酮、他莫西芬对子宫内膜癌细胞增殖及雌激素受体相关受体表达的影响[J].北京医学,2010,32(11):873-876.