季铵化纳米纤维素作为缓释材料的应用

季铵化纳米纤维素作为缓释材料的应用

杨艳1董树清2高瑞斌3王利涛2郭梅3赵亮

杨艳1董树清2高瑞斌3王利涛2郭梅3赵亮2倪京满1

（1兰州大学药学院甘肃兰州730000）

（2中国科学院兰州化学物理研究所甘肃西北植物资源与天然药物重点实验室甘肃兰州730000）

（3甘肃省中医学院化学质量重点实验室甘肃兰州730000）

【摘要】纳米纤维素（NCC）是一种新型的纳米材料，因其表面羟基较多，水溶性较差，在生物医药应用方面受到局限。将NCC表面的羟基进行衍生化，首先将NCC碱化，然后用醚化试剂3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵醚化生成季铵化NCC；并对其作为缓释载体进行了考察，将其与镇痛模型药物在适量的条件下孵育形成纳米粒子，对该纳米粒子进行体外释放及动物体内的镇痛活性实验。衍生的季铵化NCC由于表面的羟基减少，氢键作用减弱，水溶性增加；其形成的纳米粒子可在体外缓慢释放，释放率为80%左右；在动物体内具有镇痛活性，持续时间比模型药物长1h。本实验说明季铵化NCC不仅具有很好的水溶性，将其作为药物载体拥有良好的缓释能力。

【关键词】NCC季铵化NCC载体疼痛活性

【中图分类号】R318.08【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）14-0051-02

引言

NCC是一种新型的纳米材料，具有纳米级的粒径，较高的强度和模量，较强的拉升能力，较高的比表面积，低密度和表面活性基团易官能化等优点，满足于现在对低成本，可持续和可再生资源的要求，更重要的是它还满足于日益增长的环境问题和能源消耗的要求[1]。这些优越的物理化学性能和广泛的应用前景对科学研究，尤其食品和工业应用有着重要的意义[2-6]。NCC表面大量的羟基群是亲水性的本质，存在着分子间和分子内的氢键，这使得NCC很容易自身团聚造成在纳米复合物中的使用率较低。因此，通过不同官能团的修饰来降低纳米纤维素表面的亲水性是有必要的。最近通过化学修饰来降低纳米纤维素表面的亲水性被报道[7]。例如：使用表面活性剂，蓖麻油，硅烷试剂，乙酰化作用，硬脂酰氯作用，苯基异氰酸盐作用，聚乙酸内酯和其他的高分子嫁接等[8-11]，改变NCC的亲水表面，降低其表面的氢键作用从而增加它的水溶性，使得衍生化的NCC应用于各个领域中已经被报道[12-14]。

本文讨论NCC的一个醚类衍生物，阳离子型NCC醚-季铵化NCC，将NCC游离的羟基衍生成季铵盐，季铵化NCC很好的改善NCC的溶解度。并将季铵化NCC作为药物载体，将本课题组制备的内吗啡肽的类似物EN-9作为模型药物，并对其载药粒子的活性进行了研究。

1.材料与仪器

1.1材料

微晶纤维素购自山东泰安瑞泰纤维素有限公司，透析袋购自上海源叶生物有限公司，色谱乙腈购自山东禹王实业有限公司，氢氧化钠，乙醇，尿素，3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵，乙醚，磷酸氢二钾，三乙胺，醋酸，醋酸纳等均为分析纯。

1.2仪器

2.5LLABCONCO冷冻干燥机（美国Labconco公司）；TG-16-WS台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；S10-3型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；varioEL元素分析仪（德国elementar公司）；

1.3实验方法

1.3.1NCC的制备

配置100mL64%H2SO4并让其冷却备用。精密称取10g微晶纤维素于250mL的圆底烧瓶中，将冷却的64%的H2SO4缓慢地倒入微晶纤维素中。在45-50℃条件下搅拌反应2h，反应完成后加入大量的去离子水静置过夜，移除上清液；将剩下的乳浊液离心，得到混有少量微晶纤维素的粗品NCC，将粗品NCC再离心得到粒径相对均一的NCC。将制备好的NCC移入分子量为3500Da的透析袋中，在去离子水中透析1-3d，取适量的NCC冷冻干燥，备用。

1.3.2季铵化NCC的制备

分别称量H2O81.5g，NaOH11g，尿素7.5g于250mL的烧杯中，充分摇匀，放入冰箱中冷冻备用；配制2%的HCl稀溶液备用。称取2g干燥的NCC于研钵中研细，放入上述冷冻的反应溶液中反应5min，然后在10000rmin-1的条件下，离心10min，移除不溶物。将溶液倒入250mL的烧杯中，加入醚化试剂3-氯-2-羟丙基三甲基氯化铵醚化24h。反应结束后用2%的HCl溶液中和至pH=7，然后移入分子量为3500Da的透析袋中透析7d，冷冻干燥得到白色丝状固体季铵化NCC。

1.3.3季铵化NCC载药纳米粒子的制备

将季铵化NCC与模型药物EN-9按照质量比为1：1溶解在去离子水中，在室温条件下反应48h，然后离心10min，取上清液检测溶液中EN-9的含量，按下式计算包封率（LoadingEfficiency，LE）。

LE%=（W1－W2）/W1×100%

W1：投药量；W2：上清液中的药量；

根据公式计算出EN-9-季铵化NCC的包埋率为91%，

1.3.5药物的体外释放

将负载1.52mgEN-9的8.33mg季铵化NCC纳米粒子4mL水溶液移入到分量子为3500Da的透析袋中，将该透析袋放入预先配置好的20mL去离子水，置于25±1℃恒温水浴中，恒速振荡（200rmin-1）,分别在0min，10min，20min，30min，40min，50min，1h，1.5h，2h，4h，6h，12h移取1mL透析袋外的液体，及时补充1mL去离子水，将所取样品溶液经微孔滤膜过滤后HPLC进样20μL，测定峰面积得Area，计算各个时间点的相对累积释放率，测定释放的EN-9的含量。

1.3.4镇痛活性实验

昆明系雄性小鼠，体重18-22g，由兰州大学实验动物中心提供。实验前一周，所有动物分笼饲养（7-8只/cage），科学喂养。

样品分组：生理盐水组，EN-9原料药组（含EN-96mg·mL-1），EN-9-季铵化NCC纳米粒子组（含EN-96mg·mL-1），季铵化NCC组（32.5mg·mL-1），自由进食饮水，EN-9给药剂量为30mg·kg-1。甩尾仪检测药物对痛觉作用的影响。小鼠尾静脉注射各组样品0.1mL，给药前先测定基础甩尾潜伏期（3-5s），过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。记录给药之后第5，10，15，20，30，45，60，75，80，95，120min甩尾潜伏期。为防止烫伤，甩尾时间超过10s按10s计算。

痛觉调节作用利用MPE值来评价：MPE（%）=100×[（给药后的痛域-基础痛域）/（10秒-基础痛域）]。以时间（min）为横坐标，镇痛活性（MPE%）为纵坐标作图得小鼠尾静脉注射EN-9制剂后镇痛作用的时效曲线。

2.结果与讨论

2.1元素分析

由实验结果可知：按照摩尔比为1：1进行反应，理论上得到的C，H，N元素占整个分子的百分比分别为54.55%，9.74%，4.55%；反应完成后测量得到的C，H，N元素占整个分子百分比的实际值分别为39.77%，7.83%，1.57%。这一结果说明NCC反应不完全。但是不论是理论值还是实际值都要比每一个葡萄糖单元的值小，这是因为反应的反应物中C，H，N元素不可能占到100%，所以反应以后C，H，N元素所占的比例就会降低。

表1季铵化NCC的元素分析

元素实际值理论值糖单元

C39.7754.5550

H7.839.748.33

N1.574.55—

2.2体外释放

EN-9-季铵化NCC纳米粒子在去离子水中释放，前1.5h之内以爆发式释放主，随后为缓慢释放，释放3h以后趋于平衡，释放量不随着时间的延长而增加。EN-9在考察的时间范围内是稳定的，不产生降解。经过12h的释放之后，在去离子水检测到的EN-9的释放量为1.41±0.05mg（如图2-1）。

图1EN-9-季铵化NCC纳米粒子体外释放曲线

2.3镇痛活性

由实验结果可知：EN-9组和EN-9-季铵化NCC纳米粒子组都有镇痛作用。EN-9组的阵痛活性起效快，镇痛活性强；EN-9-季铵化NCC纳米粒子组的镇痛活性相对来说没有EN-9组的起效快，活性强，但是持续时间比EN-9组的长。造成这种结果的原因可能是EN-9-季铵化NCC纳米粒子组存在一个释放的过程，所以EN-9-季铵化NCC纳米粒子组的起效时间比EN-9组的晚，但是镇痛持续时间比EN-9组的长。这个实验结果与EN-9-季铵化NCC纳米粒子具有缓慢释放的结果相吻合（如图2-2）。

图2EN-9-季铵化纳米粒子制剂产生镇痛作用的时效曲线

3.结论

NCC因其氢键的作用不能有效的溶解在水中，而是分散在水中形成不均匀的凝胶状态从而影响NCC的使用。季铵化NCC是阳离子型NCC醚，将NCC表面的羟基衍生成季铵盐来改变它水凝胶的存在方式，且季铵化NCC保留了NCC优越的生物相容性和生物降解性等生物学优点，也拥有作为缓释载体的潜力。本论文将季铵化NCC作为缓释载体，与本课题组研究的内吗啡肽类似物EN-9孵育形成纳米粒子，并对该纳米粒子进行了体外释放和动物镇痛活性的研究。结果表明，季铵化纳米纤维素作为载体具有缓慢释放药物的能力，为它在医学载体领域的应用提供了参考。

参考文献

[1]AbrahamE.,DeepaB.,PothanL.A.,etal.Extractionofnanocellulosebrilsfromlignocellulosicbres:Anovelapproach[J].CarbohydratePolymers.2011,86,1468–1475.

[2]PengB.L.,DharN.,LiuH.L.ChemistryandApplicationsofNanocrystallineCelluloseanditsDerivatives:aNanotechnologyPerspective[J].TheCanadianJournalofChemicalEngineering.2011,9999.

[3]EdmondLam,SabahudinHrapovic,EhsanMajid,etal.atalysisusinggoldnanoparticlesdecoratedonnanocrystallinecellulose[J].Nanoscale.2012,4,997–1002.

[4]EdmondLam,KeithB.Male,JonathanH.Chong,etal.Applicationsoffunctionalizedandnanoparticle-modi?ednanocrystallinecellulose[J].TrendsinBiotechnology.2012,952,8.

[5]YoussefHabibi,LucianA.Lucia,OrlandoJ.Rojas.CelluloseNanocrystals:Chemistry,Self-Assembly,andApplications[J].ChemicalReviews2010,110,3479–3500.

[6]RobertJ.Moon,AshlieMartini,JohnNairn,etal.Cellulosenanomaterialsreview:structure,propertiesandnanocomposites[J].ChemicalSocietyReviews.2011,40,3941–3994.

[7]Hou-YongYu,Zong-YiQin.Surfacegraftingofcellulosenanocrystalswithpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)[J].CarbohydratePolymers.2014,101,471–478.

[8]KaroliinaJunkaa,IlariFilpponena,Leena-SiskoJohanssonetal.Amethodfortheheterogeneousmodi?cationofnano?brillarcelluloseinaqueousmedia[J].CarbohydratePolymers.2014,100,107–115.

[9]WilliamZ.Xu,BatiaBen-AroyaBar-Nir,JohnF.Kadla.Honeycombmembranespreparedfrom3-O-aminoacidfunctionalizedcellulosederivatives[J].CarbohydratePolymers2014,100,126–134.

[10]FengJiang,You-LoHsieh.SuperwaterabsorbingandshapememorynanocelluloseaerogelsfromTEMPO-oxidizedcellulosenanobrilsviacyclicfreezingthawing[J].TheRoyalSocietyofChemistry.2014,2,350-359.

[11]Wang,J.,Wang,Z.,Li,J.,etal.Chitinnanocrystalsgraftedwithpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)andtheireffectsonthermalbehaviorofPHBV[J].CarbohydratePolymers.2012,87,784–789.

[12]YimingZhou,ShiyuFu,LiangliangZhang,etal.Useofcarboxylatedcellulosenano?brils-lledmagneticchitosanhydrogelbeadsasadsorbentsforPb(II)[J].CarbohydratePolymers.2014,101:75–82.

[13]FortunatiaE.,RinaldibS.,PeltzerM.,etal.Nano-biocompositelmswithmodi?edcellulosenanocrystalsandsynthesizedsilvernanoparticles[J].CarbohydratePolymers.2014,101,1122–1133.

[14]SeyedehParinazAkhlaghi,RichardC.Berry,KamC.Tam.Surfacemodicationofcellulosenanocrystalwithchitosanoligosaccharidefordrugdeliveryapplications[J].Cellulose.2013,20,1747–1764.