多发性骨髓瘤分子遗传学异常与其临床预后指标的相关性研究

多发性骨髓瘤分子遗传学异常与其临床预后指标的相关性研究

张丽娜

江苏省无锡市无锡市中医医院江苏无锡214100

摘要：目的：通过检测多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）患者瘤细胞膜表面分子遗传学变化，探讨分子遗传学之间以及他们与影响预后的临床指标间的潜在关系，为MM的诊断、病情评价、预后判断、微小残留病灶检测及单克隆抗体治疗提供依据。方法：采用间期荧光原位杂交技术（interphasefluorescenceinsituhybridization，I-FISH）检测36例患者13q14缺失、P53基因异常、lq21扩增及IGH易位，探讨分子遗传学异常与各临床生物学指标间可能存在的潜在联系。结果：与正常对照组相比，55.56%的患者存在13q14缺失（包括13q14.3及RB1的共同缺失），其中在Ⅲ期患者中所占的比例高于Ⅰ、Ⅱ期患者，61.11%的III期患者存在IGH易位，两者具有相关性（r=0.378，p<0.05），但与各临床指标无相关性。

关键词：多发性骨髓瘤；荧光原位杂交技术；分子遗传学；临床疗效

多发性骨髓瘤（MM）是以浆细胞异常增生为特征的恶性肿瘤性疾病，临床表现复杂，影响预后的因素很多。其生存期可从数月到10年以上不等。这种差异主要由骨髓瘤细胞生物学和复杂的宿主因素所决定。目前多数研究认为，血清β2-微球蛋白（β2-MG）、白蛋白（ALB）、C反应蛋白（CRP）水平，Durie-Salmon（DS）分期及细胞遗传学异常如del（13q14）等与疾病的预后相关[1]。通过间期荧光原位杂交检测骨髓瘤细胞分子遗传学特点，已经作为血液系统疾病的常用检测手段，其在辅助诊断、预后评估方面的价值也被越来越多的学者认同。

1资料

1.1一般资料

2014年6月-2017年8月我院血液科MM初诊患者36例，所有患者均进行外周血细胞计数、骨髓象分析、X线摄片和免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、乳酸脱氢酶、C反应蛋白等测定，诊断均符合国内诊断标准[2]。治疗方案中均未使用过单克隆抗体治疗即非靶向治疗。男20例，女16例，中位年龄63岁。M蛋白免疫分型：IgG型20例，IgA型10例，轻链型6例。Durie-Salmon临床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期15例。ISS临床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例。均对其行间期荧光原位杂交检测。正常对照20例，为同期染色体正常的营养性缺铁性贫血患者，中位年龄53.5岁。

1.2临床分期

Durie-Salmon分期：Ⅰ期：骨髓瘤细胞总数<0.6×1012/m2。全符合下列条件：①血红蛋白>100g/L；②血钙正常；③骨骼X线正常或呈孤立性溶骨病变；④M蛋白：IgG<50g/L，IgA<30g/L，尿轻链<4g/24h。Ⅱ期：瘤细胞数（0.6-1.2）×1012/m2，各项标准介于I期和Ⅲ期之间。Ⅲ期：瘤细胞数>1.2×1012/m2。符合下列至少一项：①血红蛋白<85g/L；②血清钙>2.98mmol/L；③X线多处进行性溶骨性损害；④M蛋白：IgG>70g/L，IgA>50g/L，尿轻链>12g/24h。

国际分期（ISS分期）：Ⅰ期：血清β2-MG<3.5mg/L和血清白蛋白>35g/L。Ⅱ期：血清β2-MG<3.5mg/L和血清白蛋白<35g/L；或血清β2-MG≧3.5mg/L但<5.5mg/L。Ⅲ期：血清β2-MG>5.5mg/L。

1.3预后风险分组

参考相关文献FISH预后风险组：以是否存在del（13q14）和（或）del（17p13）把病例组按预后风险分组为高危组（del13q14）和标危组（del17p13）2组。[3]

2.方法：间期荧光原位杂交

2.2.1主要仪器

离心机：北京飞鸽牌高速离心机

高分辨荧光显微镜：OLYMPUSBX51，日本

高级恒温水浴锅，37℃和72℃恒温水浴锅：上海医疗器械厂

2.2.2主要试剂

PH7.4的PBS

RPMI1640培养基

0.02%肝素

秋水仙胺：浓度为5ug/ml，4℃保存备用。

0.075mol/LKCL

3：1甲醇/冰醋酸固定液

探针：针对13q14序列特异性DNA探针D13S319、RB1，针对14q32序列特异性DNA探针LSIIGHC/IGHV均购自北京金菩嘉公司。标记探针-20℃保存备用。

2.2.3主要方法

采用针对13q14的D13S319及RBlDNA探针、针对14q32的IGHDNA探针、针对17p13的P53DNA探针、针对lq21扩增的lq21DNA探针。取储存于-20℃的病人染色体标本，按照产品说明书操作，予以变性、杂交、洗片、复染，在DAPI/FITC/RHOD滤光片的激发下观察细胞中桔红色和绿色荧光信号，每例至少分析200个细胞，计数边界清楚，无重叠，结构完整的细胞核，用德国耶拿CCD摄像头进行图像采集，使用IMSTAR软件进行图像分析。根据正常对照组Ⅹ±3S以确定RB1、D13S319、P53、1q21、IGH位点的阈值，阈值分别为6.1%、5.2%、6.3%、3.4%、1.2%。MM患者如果检测值大于阈值，判定为阳性结果。

2.2.4统计学方法

收集两组研究对象的数据，进行整理，并建立数据库，采用SPSS20.0分析，计数资料，描述应用（n%），应用X2检验，P<0.05，具有统计学意义。

3结果

3.1I-FISH分析基因组异常

根据正常对照组Ⅹ±3S以确定本研究中RB1、D13S319、P53、1q21、IGH位点的阈值，阈值分别为6.1%、5.2%、6.3%、3.4%、1.2%。36例患者中有20例（55.56%）存在13q14缺失（包括13q14.3及RB1的共同缺失），22例（61.11%）存在IGH易位，P53异常8例（22.22%），其中有1例患者信号扩增，缺失患者7例，1q21异常的患者13例（36.11%），2例完全缺失，扩增11例。

3.2分子遗传学异常与临床指标的相关性研究

20例13q14缺失的患者中，Ⅰ期占11.11%（4/36），Ⅱ期占13.89%（5/36），Ⅲ期占30.56%（11/36），22例IGH易位的患者中，Ⅰ期占13.89%（5/36），Ⅱ期占19.44%（7/36），Ⅲ期占27.78%（10/36），8例P53异常患者，Ⅰ期占5.56%（2/36），Ⅲ期占16.67%（6/36），13例1q21异常的患者，其中Ⅰ期占11.11%（4/36），Ⅲ期占25%（9/36），Ⅲ期患者所占的比例均高于Ⅰ、Ⅱ期患者（见表1），61.11%的III期患者存在IGH易位，两者具有相关性（r=0.378，p<0.05），但未发现各遗传学异常与临床分期、免疫球蛋白分型及实验室指标差异有统计学意义。

4讨论

MM患者的临床特征、自然病程及预后存在明显的异质性，对MM细胞的细胞遗传学和分子细胞遗传学研究表明几乎所有的MM都存在克隆性染色体异常，其预后评估中亦有重要的作用，在多变量分析中是比免疫表型更重要的预后因素。13号染色体部分或完全缺失是MM常见的核型异常，存在于MM的各个阶段并且是复发和预后的不良因素[4]。Zojer等采用I-FISH技术研究MM的13q14缺失，结果显示13q的Rbl和D13S319位点缺失分别占46.2％（48/104）和38.9％（28/72），进一步与临床因素比较发现Durie-Salmon分期越高、β2-MG及浆细胞比例越高越容易发生del（13q14），并且认为13q14缺失的患者总生存期短（24.2mVS>60m，P<0.005），对传统剂量化疗反应性差（40.8%VS78.6%，P=0.009）[5]。本研究中16例（44.44%）检测到del（13q14.3），24例（66.67%）存在RB1缺失，20例（55.56%）存在del（13q14）（包括13q14.3及RB1的共同缺失），与国外研究结果相近但与既往报道不同[6]，并未发现13q14缺失在疾病分期、分型及β2-MG等临床因素中存在显著差异性，很可能因为三期病例及总病例数较少有关，但研究发现20例13q14缺失的患者中，Ⅰ期占11.11%（4/36），Ⅱ期占13.89%（5/36），Ⅲ期占30.56%（11/36），与文献[7]报道相似，但由于本研究例数较少，有待扩大样本例数进一步验证。

参考文献：

[1]郝玉书，王建祥，肖志坚，主编．白细胞疾病基础理论与临床．第1版．上海：上海科学技术出版社，2006．711-738．

[2]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京：科学出版社，2007：232-235

[3]DispenzieriA，RajkumarSV，GertzMA，etal.TreatmentofnewlydiagnosedmultiplemyelomabasedonMayoStratificationofMyelomaandRisk-adaptedTherapy（mSMART）：consensusstatement.MayoClinProc.2007.82（3）：323-41.

[4]TrcicRL，SkelinIK，SustercicD，etal.Cytogeneticsofmultiplemyeloma.CollAntropol.2010.34（1）：41-4.

[5]ZojerN，KonigsbergR，AckermannJ，etal.Deletionof13q14remainsanindependentadverseprognosticvariableinmultiplemyelomadespiteitsfrequentdetectionbyinterphasefluorescenceinsituhybridization.Blood.2000.95（6）：1925-30.

[6]BatailleR，Pellat-DeceunynckC，RobillardN，Avet-LoiseauH，HarousseauJL，MoreauP.CD117（c-kit）isaberrantlyexpressedinasubsetofMGUSandmultiplemyelomawithunexpectedlygoodprognosis.LeukRes.2008.32（3）：379-82.

[7]ZellT，3rdHSW，MobleyJL，FinkelsteinLD，ShimizuY.CD28-mediatedup-regulationofbeta1-integrinadhesioninvolvesphosphatidylinositol3-kinase.JImmunol.1996.156（3）：883-6.