PAMAM作为抗肿瘤药物靶向载体的体内外研究

PAMAM作为抗肿瘤药物靶向载体的体内外研究

徐俊明

徐俊明

（山东省青岛平度市中医医院山东青岛266700）

【摘要】树枝状大分子是一种高分子材料，其在抗肿瘤药物载体领域应用较为广泛，由于聚酰胺-胺型大分子（PAMAM）的水溶性、靶向性以及生物利用度均较为理想，应用前景备受看好，现已成为该领域研究的热点。本实验通过细胞毒性实验和载体活体靶向性研究，先进行细胞培养、细胞换液、细胞传代和细胞冻存，另行MTT实验和细胞转染吸收实验；分解小鼠活体器官，建立肿瘤模型，进行体内靶向实验，另行载药及释放性能研究，在此基础上分析PAMAM对细胞的生物特性，对化疗药物的包埋、细胞吸收和毒性性能，以及体内靶向性。实验结果证明，靶向载体的生物相容性较为理想，多肤具有靶向性，载体对DOX具有较好的缓释作用，提示抗肿瘤纳米靶向载体PAMAM-Ac-FITC-LCTP可介导化疗药物进入肿瘤细胞及相关组织。

【关键词】聚酰胺-胺；抗肿瘤药物；肿瘤靶向；载体

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）18-0219-02

对于肿瘤特别是恶性肿瘤的治疗，现多采用手术、放疗和化疗综合方案，但是化疗药物的应用一直存在的很大局限性，近年来，这方面的研究取得了很大的进展，靶向载体给药系统便是其中一项重要内容，具体可将其分为载体和靶向两个方面，就载体而言，人工合成的有机高分子材料备受关注，基于纳米材料的聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM）更为该领域的研究重点[1]。现将PAMAM作为抗肿瘤药物靶向载体的体内外实验研究情况报道如下。

1.材料及方法

1.1实验材料

所用仪器包括旋转蒸发仪、酶联免疫检测仪、细胞计数仪、超声波清洗器、冷冻真空干燥机、紫外分光光度计、超速离心机、恒温培养箱、电子天平等，所有试剂有NaHCO3、EDTA、LCTP多肽、DMSO、TES、FBS、戊巴比妥那、阿霉素、RPMI1640培养基、DMEM培养基等。H46O细胞、C6细胞、Hela细胞和293T细胞均为本实验保存，Balb/C小鼠（均为雌性，四周龄）购自陕西省医学动物实验中心。自行配制PBS缓冲液（用HCI调节pH至7.4）、细胞冻存液、TES生物缓冲液缓冲液（pH为7.4）、EDTANa2溶液、MTT溶液、双抗溶液（青霉素和链霉素）[2]。

1.2实验方法

1.2.1细胞毒性实验培养细胞包括人非小细胞肺癌细胞系NCI-H460细胞、人宫颈癌细胞系Hela细胞、人神经胶质瘤细胞系C6细胞和人正常肾上皮细胞系293T细胞，具体过程为：①细胞培养。紫外消毒15min，取适量培养基放入培养瓶，将H46O细胞、Hela细胞和293T细胞从冻存管中取出并迅速溶化，获取细胞悬液，离心，取上清，摇匀，接种到培养瓶中，置入培养箱（条件为37℃、5%CO2）中培养。②细胞换液。常规处理后，将培养基、PBS放入37℃恒温水浴中预热，取出细菌培养瓶，吸取旧培养基，去PBS，加入新鲜培养基，再置入培养箱中培养。③细胞传代。取出细菌培养瓶，用PBS冲洗，加入酶蛋白酶液（1ml），细胞变圆后，再加入培养基终止胰酶（1ml），去悬液，离心，弃上清液，加入新鲜培养基，置入培养箱中继续培养，显微镜下细胞计数，包括细胞总数和细胞浓度。④细胞冻存。将冻存管放入冻存盒，一同放入-80℃冰箱内冻存。

另行MTT实验，基本步骤为：铺板、培养细胞、给各纳米材料编号、配置原液并除菌、酉己置含药培养基和加含药培养基、培养板置入培养箱并加入MTT溶液、记录酶联免疫测定结果[3]。在上述实验基础上进行细胞转染吸收实验，先确定材料转染浓度和转染时间，最佳浓度为最佳浓度为0.5μmol/L，时间为4h，分别培养293T、Hela、H460和C6细胞株，参照基本步骤。

1.2.2载体活体靶向性研究分解小鼠活体器官，观察载体进入体内后的代谢情况及肿瘤靶向性，具体过程为：①建立肿瘤模型。将小鼠放入SPF级动物房分笼饲养，培养NCI-H460细胞，接种于小鼠前肢腋下皮下，观察瘤块生长情况，达到0.4cm左右，进行体内靶向实验。②体内分布实验。配制PAMAM-Ac-FITC和PAMAM-Ac-FITC-LCTP水溶液，各10μmol/L，将小鼠分组，腹腔麻醉，观察活体，4h后处死，取脏器、肿瘤及输卵管等组织，成像，确定载体体内分布[4]。另行载药及释放性能研究，包括绘制DOX标准曲线、确定靶向载体对DOX的包埋及包埋量，分别对靶向药物载体的细胞毒性和细胞吸收进行评价。

2.结果

2.1细胞毒性实验结果

实验结果显示，未乙酞化的PAMAM有细胞毒性，最大给药剂量达到10倍浓度时，仍未达到半致死剂量；乙酞化后的材料细胞毒性得到大幅度降低，其中293T细胞的存活率约为90%（给药浓度为4μmol/L）；FITC连接或多肽连接后，细胞毒性更低，证明靶向载体的生物相容性较为理想。实验中，纳米材料对肿瘤细胞的吸收效率较高，在0.5μM时已基本达到饱和，材料的转染效率在90%以上，而对正常细胞293T的吸收效率则相对较低，仅为20%，在此条件下，转染浓度的增加对细胞吸收效率的影响并不大；在0.25μM时，Hefa细胞对PAMAM-Ac-FITC的吸收效率低，对其他材料的吸收效率均较高，前者持续8h仍未超过80%，后者4h内就已达到80%，证明多肤具有靶向性。

2.2活体靶向性研究结果

观察标准曲线，DOX最大吸收峰为481nm，取2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml浓度下吸光值，分别为0.0331、0.0887、0.1722、0.8048，在检测浓度范围内具有良好的线性，载体对DOX具有较好的缓释作用，通过增加离子强度来改变pH值，可促使DOX迅速释放，PMAM-Ac-FITC-LCTP对其最大包埋率为7.5%，在载体使用剂量为0.5μmol/L时，细胞存货率约90%，随着浓度上升，存活率下降，而DOX与游离DOX的细胞毒性基本一致。

3.讨论

抗肿瘤纳米靶向载体PAMAM-Ac-FITC-LCTP具有低毒性、良好生物相容性等特点，可介导化疗药物进入肿瘤细胞及相关组织，证实其能够将化疗药物运输到肿瘤部位，减轻其毒副作用，至于如何将其应用到实践中，将成为今后该领域研究中的重点。

【参考文献】

[1]冯丽娜，刘金剑，褚丽萍等.新型多肽聚酰胺-胺型靶向药物载体的载药性能及细胞吸收和毒性[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（8）:1386-1388.

[2]刘振林，李罡，苏治国等.叶酸/聚酰胺-胺作为miR-7基因载体的胶质瘤靶向性研究[J].肿瘤防治研究，2012，10（1）:4-5.

[3]宋玮，姜忠敏，徐萍等.纳米分子PAMAM作为miR药物载体靶向胃腺癌的功能研究[J].天津医药，2013，12（5）:1147-1149.

[4]李罡，胡海洋，乔明曦等.基于PAMAM复合脂质载体的分级肿瘤主动靶向给药系统的构建及其性质考察[J].沈阳药科大学学报，2013，10（3）:752-754.