新疆胀果甘草总黄酮的提取、精致与鉴定研究

新疆胀果甘草总黄酮的提取、精致与鉴定研究

阿提合尼木·艾买提１木合布力·阿布力孜２（通讯作者）刘恒

阿提合尼木·艾买提１木合布力·阿布力孜２（通讯作者）刘恒戈１艾尼瓦尔·买买提１买迪娜．买买提１

（１．新疆医科大学附属肿瘤医院药学部新疆乌鲁木齐８３０００７）

（２．新疆医科大学药学院药物化学教研室新疆乌鲁木齐８３０００７）

【中图分类号】Ｒ２８４．１【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１

【摘要】目的：对胀果甘草进行总黄酮的提取，并对总黄酮提取物进行鉴定分析。方法：用乙醇提取－超声辅助等法制备胀果甘草提取物；用硅胶柱层析法对总黄酮进行精制；用制备薄层色谱法和重结晶法对单体成分进行分离纯化；用理化鉴别法、薄层色谱法和光谱分析法对甘草黄酮类提取物及单体进行分析。结果：制备四种总黄酮粗提物和一种精制总黄酮；分离纯化一种单体成分；对总黄酮类提取物的薄层特点和理化性质进行详细的描述；对单体成分进行结构鉴定。结论：（１）利用碱溶酸沉法提取的总黄酮出膏率低于其他提取法，但总黄酮质量较高；（２）硅胶柱层析法可明显提高甘草总黄酮组分的纯度；（３）所分离纯化的单体成分鉴定为甘草查尔酮Ａ。上述的研究结果为中药材甘草的质量控制提供一定的参考依据

【关键词】胀果甘草；总黄酮；提取制备；分离纯化；鉴定分析

传统医学认为甘草有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，有“十方九草”之说。据《中国药典》２０１０年版一部记载其原植物有３种，即乌拉尔甘草（ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓＦｉｓｃｈ），胀果甘草（Ｇ．ｉｎｆｌａｔｅＢａｔ）．和光果甘草（Ｇ．ｇｌａｂｒａＬ）［１］。国内外已从甘草中分离出ｌ００多种黄酮类化合物、６０多种三菇类化合物以及香豆素类、１８种氨基酸、多种生物碱、雌性激素和多种有机酸等［２］。甘草黄酮类成分具有明显的抗氧化作用，可预防肿瘤发生，治疗胃溃疡、肝损害，在抗炎和抗变态反应等方面也有明显的药理作用［３］。最新研究还发现，甘草黄酮类物质对艾滋病（ＨＩＶ）的治疗有明显的疗效，它对ＨＩＶ病毒的抑制作用是甘草甜素的２５倍［４］，为甘草黄酮类化合物的进一步研究提供了一定的研究基础。本研究以超声辅助的有机溶剂提取法及氢氧化钙溶解／盐酸沉淀的提取方法与传统的有机溶剂提取法等４种不同方法制备甘草总黄酮提取物，并以出膏率和质量为指标对提取效果进行考察；利用硅胶柱层析法对总黄酮提取物进行精制纯化；利用制备薄层法对单体成分进行分离纯化；利用薄层色谱法和理化鉴定法对各提取物进行鉴定分析。为中药材胀果甘草的品种鉴定、资源考察及产品的质量控制提供一定的参考依据。

１材料与方法

１．１药材新疆胀果甘草：由新疆医科大学天然药物化学教研室提供，新疆医科大学生药教研室帕丽达教授鉴定；新疆光果甘草：由新疆医科大学天然药物化学教研室提供，新疆医科大学生药教研室帕丽达教授鉴定。

１．２仪器与试剂

（１）仪器：Ｕｎｉｔｙ－Ｉｎｏｖａ６００超导核磁共振谱仪（美国Ｖａｒｉａｎ公司）；ＩＲＰｒｅｓｔｉｇｅ－２１红外光谱仪（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）；ＡＢ１０４－Ｎ电子天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ－ＴｏｌｅｄｏＧｒｏｕｐ）；ＤＴ２００型电子分析天平（常熟市衡器厂）；ＳＨＢ－１１１Ａ型循环水式多用真空泵（郑州长城科共贸有限公司）；ＳＫ２５１０ＨＰ型数控超声清洗仪（上海科导超声仪有限公司）；Ｎ－１００１型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；ＺＦ－２０Ｃ暗箱式紫外分析仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；ＷＲＳ－１Ａ型数字式熔点测定仪（上海精密科学仪器有限公司），ＨＨ－Ｓ恒温水浴锅，粉碎机，薄层层析硅胶ＧＦ２５４（德国Ｍｅｒｃｋ），普通玻璃仪器。（２）药品和试剂：无水乙醇，氢氧化钙（ＡＲ），甲醇（ＡＲ），乙酸乙酯（ＡＲ），石油醚（ＡＲ），三氯甲烷（ＡＲ），

１，２－二氯甲烷（ＡＲ），甲酸（ＡＲ），蒸馏水，正己烷（ＡＲ），羧甲基纤维素钠，柱层析硅胶，查尔酮Ａ标准品（美国Ｓｉｇｍａ公司）。

２方法与结果

２．１胀果甘草总黄酮的制备

２．１．１总黄酮粗提物的制备（提取物Ａ，Ｔ－Ａ）将干燥胀果甘草根粉碎，过２０目筛，精密称取粉末５０ｇ，置烧杯中，加７５％乙醇４００ｍｌ，室温浸泡８小时，分别利以下四种方法进行提取，制备粗提物，并根据出膏率和粗品质量评价提取效果：

（１）乙醇－超声辅助提取并用Ｃａ（ＯＨ）２溶解／盐酸沉淀法：将浸泡八小时的甘草乙醇液放入水浴锅中，先６０℃加温提取两小时，然后以超声辅助提取２５分钟，过滤取滤液，药渣用７５％乙醇同法处理１次，体积为２００ｍｌ，合并滤液；将半体积的饱和Ｃａ（ＯＨ）２溶液与滤液混合并搅拌溶解，静置分层，取下层液用浓盐酸滴定至ｐＨ２．５，洗出沉淀，静置１ｈ后抽滤。所得固体为粗制胀果甘草总黄酮，经真空干燥得干燥浸膏，出膏率为１２．５％。

（２）乙醇提取－Ｃａ（ＯＨ）２溶解／盐酸沉淀法：取５０ｇ的甘草粉末，其余条件同２．２．１．１（１）项下，经冷冻干燥得干燥浸膏，出膏率为１２．５％。

（３）乙醇－超声辅助提取法（免去Ｃａ（ＯＨ）２溶解／盐酸沉淀操作）：将浸泡八小时的甘草粉末乙醇液放入水浴锅中，用超声辅助提取２５分钟，过滤，药渣按同法处理一次，合并浸出液，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状后，经冷冻干燥干燥浸膏，出膏率为１７．６％。

（４）简单的乙醇提取法：将浸泡八小时的甘草粉末乙醇液放入水浴锅中，在６０℃加温度下提取两小时，过滤，药渣按同法处理一次并过滤，合并滤液，减压浓缩至膏状，经冷冻干燥干燥浸膏，出膏率为１４．８％。２．１．２胀果甘草总黄酮的精制（提取物Ｂ，Ｔ－Ｂ）据文献报道，总黄酮精制方法有聚酰胺柱层析法、大孔树脂法和硅胶柱层析法等三种。本研究中，根据预实验结果和以获得胀果甘草种属特异性成分甘草查尔酮Ａ的制备和鉴定为主要目标，利用硅胶柱层析法和制备薄层法对总黄酮进行精制纯化。

（１）利用硅胶柱层析法精制：称取６０ｇ柱层析用硅胶，加入足量１，２－二氯乙烷，浸泡１ｈ，按湿法装柱。称取２ｇ胀果甘草总黄酮粗提物，溶于２ｍｌ甲醇中，加少量硅胶拌匀成膏状，放入柱层析硅胶上端，覆盖一层滤纸，滤纸上放６粒玻璃珠压住，并用１，２－二氯乙烷／甲醇／乙酸乙酯（３：０．５：１）的洗脱液洗脱，收集具有甘草查尔酮Ａ特征的黄色色带洗脱液；洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩至干，得到黄色精制总黄酮提取物（提取物Ｂ）０．１２ｇ。用乙酸乙酯－石油醚进行重结晶，析出亮黄色结晶０．０１３ｇ。

（２）利用制备薄层法精制：用自制的制备薄层板（２０×２０ｃｍ，０．３ｍｍ），将粗制总黄酮提取物Ａ用少量甲醇溶解并点样，以１，２－二氯乙烷／甲醇／乙酸乙酯（３：０．５：１）为展开系统，在紫外光下显色，将具有甘草查尔酮Ａ特征的色带划线标记，并用刀片刮取，用甲醇提取；将６次展开得到的色带的甲醇提取物合并，减压浓缩至干，黄色提取物固体用乙酸乙酯－石油醚重结晶，得少量亮黄色针状结晶。经按光谱分析法（以下２．３．５）对成分进行结构鉴定。

２．１．３光果甘草总黄酮粗提物的制备（提取物Ｃ，Ｔ－Ｃ）为了对照两种甘草的薄层色谱特征，以新疆光果甘草根为原料，按

２．２．１．１（４）法制备粗制总黄酮Ｃ（Ｔ－Ｃ），得率１４．２％，提取物备用。

２．２胀果甘草总黄酮的鉴定方法所得到的四种总黄酮粗提物（提取物Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４）、精制总黄酮（提取物Ｂ）和黄色结晶（单体物）等样品经ＴＬＣ鉴定法、理化鉴定法、光谱鉴定法等鉴定方法进行鉴定。鉴定方法如下：

２．２．１ＴＬＣ鉴定法：用进口铝板硅胶ＧＦ２５４板，以醋酸乙酯／甲酸／水（８∶３∶１）为展开剂进行薄层特征的鉴定，观察斑点数量、颜色，计算比移值（Ｒｆ）。

２．２．２物理鉴定法：对各提取物进行形状、颜色和溶解性能的鉴定；对结晶性单体物还进行熔点测定。

２．２．３化学鉴定法：样品用盐酸－镁粉试液、三氯化铝试液、紫外灯３６５的荧光特征、氢氧化钠水溶液等黄酮的化学鉴别试剂进行显色特征的鉴定。

２．２．４单体的光谱鉴定法：单体结晶性物质用核磁共振法和红外光谱法进行结构鉴定。

２．３胀果甘草总黄酮粗提物的出膏率及提取效果用四种方法制备的胀果甘草总黄酮提取物的出膏率如表１所示。

从表１可知，超声辅助的乙醇提取／碱溶－酸沉法（Ｔ－Ａ－１）出膏率较低，但产品质量较好，不需冷冻干燥处理。

２．４胀果甘草总黄酮提取物的物理鉴定结果

（１）四种总黄酮粗提物（ＴＡ１～４）：棕色粉末，均易溶于乙醇和甲醇中，溶于乙酸乙酯和氯仿，略溶于乙醚和水。

（２）精制总黄酮（ＴＢ）：黄色粉末，易溶于乙醇和甲醇，溶于乙酸乙酯、氯仿和乙醚，略溶于石油醚和水。

（３）单体（Ｍｏｎｏｍｅｒ，Ｍ）：亮黄色针状结晶，熔点（ｍｐ）１５５．７～１５７．６℃；易溶于乙醇和甲醇，溶于乙酸乙酯、氯仿和乙醚，略溶于石油醚，不溶于水。

２．５胀果甘草总黄酮提取物的化学鉴定结果：样品乙醇溶液用盐酸镁粉鉴别后呈红色；遇三氯化铝，在紫外灯３６５下有荧光；遇氢氧化钠水溶液呈亮红色，显示黄酮类化合物的一般显色特征。

２．６胀果甘草总黄酮提取物的ＴＬＣ鉴定结果：对胀果甘草的四种总黄酮粗提物（Ｔ－Ａ１－４）、精制总黄酮（Ｔ－Ａ）、胀果甘草和光果甘草总黄酮粗提物（Ｔ－Ａ和Ｔ－Ｃ）的ＴＬＣ进行鉴定，结果如下。

（１）四种总黄酮粗提物（Ｔ－Ａ１－４）：ＴＬＣ特征如图２所示。从图２可见，粗提物ＴＡ－１至ＴＡ－４的薄层斑点上，至少有１０个斑点，其中７－８个斑点有紫外荧光特征；这些提取物都具有与对照品甘草查尔酮Ａ（ＬｉｃｏＡ）相适应的亮黄色荧光斑点（Ｒｆ＝０．８９），即适合胀果甘草的特征。

图２．粗提物ＴＡ１～４的薄层特点

（硅胶ＧＦ２５４板，展开剂二氯乙烷／甲醇／乙酸乙酯（３：０．５：１）此外，提取物ＴＡ－１和ＴＡ－２的薄层板点上，处于下方的极性大的斑点很弱，说明乙醇－提取并用Ｃａ（ＯＨ）２溶解／盐酸沉淀法制备总黄酮提取物时，总黄酮的纯度略高，可以分离大部分极性大的物质，因此出膏率小于其他提取方法。

（２）精制总黄酮（ＴＢ）与粗制总黄酮提取物（ＴＡ）：薄层特征的对照如图３所示。从图３可见，精制总黄酮显示６个斑点，与粗品对照，下方极性大的２－３个半点消失，几乎均为带荧光的黄至蓝色斑点，有明显的甘草查尔酮Ａ的斑点出现。结果表明，经硅胶柱层析法纯化之后，可最大限度的富集总黄酮组分，可提高纯化的效果。（硅胶ＧＦ２５４板，展开剂二氯乙烷／甲醇／乙酸乙酯（３：０．５：１）。

３讨论

本实验中，以新疆胀果甘草为研究对象，首先通过四种提取方法制备总黄酮粗提物；然后通过柱层析富集分离法制备其精制总黄酮类组分；利用物理化学方法和定性薄层色谱法对总黄酮提取物进行鉴定，其理化性质和色谱特征进行描述；利用制备薄层层析法和重结晶法对单体成分甘草查尔酮Ａ进行分离纯化；利用物理化学法、红外光谱法和核磁共振法对单体成分的化学结构进行鉴定。从而为胀果甘草总黄酮的提取制备、分离纯化、理化鉴别、色谱和光谱鉴定等方面获得了较好的实验结果。此外，通过利用简单的薄层色谱法，对甘草黄酮类提取物的不同制备方法的效果进行初步的评价；同时利用薄层色谱法、以甘草查尔酮Ａ为对照品，对胀果甘草进行有效的鉴定，从而建立了用薄层色谱法对胀果甘草药材品种的快速鉴定方法，从而为甘草药材的快速生药学鉴定提供了简便快速的鉴定方法。

参考文献

［１］国家药典委员会．中国药典［Ｓ］．北京：化学工业出版社，２０１０：８０－８１．

［２］陶哺，刘晓清，屈振刚．甘草化学成分研究进展［Ｊ］．河北农业科学，２００９，３（１３）：７７－７９．

［３］付玉杰，祖元刚，李春英，等．超临界ＣＯ２萃取甘草中甘草次酸的工艺研究［Ｊ］．中草药，２００３，３４（１）３１－３３．

［４］ＷｅｉＷ．Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｍｅｄｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｆｏｒｌｉｑｕｏｒｉｃｅ［Ｊ］．ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５（６）：１－２．

［５］李宏智，木合布力．阿布力孜，闵杰．甘草查尔酮Ａ的高效制备工艺研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１０，２２（增刊）：１１２－１１４