蒙古旱獭疫源地鼠疫宿主动物DNA条形码研究

蒙古旱獭疫源地鼠疫宿主动物DNA条形码研究

常子丽张忠兵刘芳李振林赵成祥杨晓娟范蒙光

1.内蒙古自治区地方病防治研究中心呼和浩特010031

【摘要】[目的]为了探究应用DNA条形码技术对鼠疫宿主动物进行分子生物学鉴定的可行性。[方法]本研究检测了内蒙古蒙古旱獭疫源地6种啮齿动物的75条线粒体COⅠ基因657bp的片段序列，用MEGA5.0软件计算GC含量，经过双参数法计算遗传距离，采用邻接法（NJ）构建分析系统发育树。[结果]所有序列富含AT，所有物种G含量及第3位的G含量均较少，各鼠种碱基含量随着物种以及密码子位置的不同而不同。种内平均遗传距离为0.1%，不同鼠种间平均遗传距离为22.63%，NJ进化树能清楚的区分6个不同的类群。[结论]内蒙古蒙古旱獭疫源地的鼠疫宿主动物通过COⅠ基因应用DNA条码技术可以进行鉴别，同时认为近年蒙古旱獭疫源地达乌尔黄鼠为优势种。

【关键词】DNA条形码；COⅠ基因；鼠疫

【中图分类号】Q342+.2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2015）-10-006-02

蒙古旱獭疫源地处于呼伦贝尔高原北部草原地带，东经115°50′～121°18′，北纬48°20′～49°50′之间，其范围涉及满洲里市和陈巴尔虎旗、新巴尔虎左旗、新巴尔虎右旗、鄂温克旗及牙克石市的一些地区。根据70年代后期动物病调查队的调查和80年代以来系统的鼠疫监测结果，在该疫源地共发现各种啮齿动物21种[1]。但近年来在蒙古旱獭疫源地共获鼠14种[2]，其中常见种有达乌尔黄鼠、长爪沙鼠、蒙古旱獭、黑线毛足鼠、五趾跳鼠等，蒙古旱獭为优势种，在该疫源地2000-2011年见共有2种啮齿动物（达乌尔黄鼠和五趾跳鼠）自然感染鼠疫，为了准确了解疫源地内啮齿动物的种类和数量，现利用DNA条形码方法结合形态鉴定对蒙古旱獭疫源地内的鼠疫宿主动物进行鉴定研究。

1材料和方法

采集内蒙古自治区呼伦贝尔高原蒙古旱獭鼠疫自然疫源地内的啮齿动物，现场初步进行鼠种形态鉴定，同时进行性别、年龄鉴定和体尺测定后，带回实验室解剖取肝脏组织，-80℃冷藏保存备用，实验样品信息见表1。

啮齿动物肝脏组织基因组DNA提取方法按照TaKaRa试剂盒指导书（D305A）的操作步骤进行。扩增时所用引物及使用条件参考Robins等[3]（2007）的鼠类通用引物和Ivanova等[4]（2007）的鸡尾酒引物，并由上海生工生物技术有限公司合成。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验样品的完整性，检测合格的PCR产物直接送上海生工双向测序。同一份样品进行3次PCR试验，测序时应用自带的鸡尾酒引物。测序成功的序列首先用Chromos软件观察测序峰图质量，如果峰图质量很差，不能准确判断碱基，则重新进行扩增和测序。再用ClustalX软件进行多重序列比对，并进行适当的手工调整。然后将测定的序列在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较，以确保所获得的序列是目标序列。最后运用Mega5软件分析各基因序列的碱基组成和变异，基于K2P（Kimura-2-parameter）模型计算各物种的遗传距离。采用邻接法构建全部COⅠ基因序列的NJ（Neighbor-Joining）系统树，对NJ树进行内部分支检验与1000次Bootstrap检验分析，来确定各支系的置信度。

表1实验样品信息

2结果与分析

本文共获得75条COⅠ基因序列片段（每条序列长度657bp），对所有序列的阅读框架进行确认，避免核基因组中的假线粒体基因序列干扰。75个样本属于2目5科6属6种。

2.1COⅠ基因序列分析

2.1.1变异位点分析

对6种啮齿动物75条序列COⅠ进行比对，发现有变异位点234个。所有DNA条码都是物种所独有，不存在物种之间的共享；对所涉及的6个物种，每个物种都有各自的鉴别位点。

2.1.2GC含量分析

各种碱基含量随着物种和密码子位置的不同而不同。达乌尔鼠兔和五趾跳鼠核苷酸含量C>T>A>G，而其他4个鼠种的核苷酸含量T>A>C>G，其差别主要来自于C碱基含量的差别。这些序列大部分是富含AT，GC含量差别较大。五趾跳鼠和达乌尔鼠兔的GC含量较高，而达乌尔黄鼠的GC含量则较低（见表2）。该差别来源于密码子第1、3位的GC含量的差别，主要是第3位的差别所致（见表3），第2位的GC含量几乎无差别。所有物种第3位的G含量均较少。

表2各鼠种碱基含量表（AV±SE）

表3各鼠种不同密码子位置GC%含量表（AV±SE）

2.2K2P遗传距离分析

2.3进化树分析

基于COⅠ序列，应用邻位相连法（NJ）构建的进化树图中可看出，各鼠种被分成各自不同的类群，能清楚的区分6个不同的品种。

3.讨论

Hebert等[5-8]选取COⅠ基因对动物不同种群进行种类鉴定，发现同属各种COⅠ序列的平均差异程度是11.3%，而种内的COⅠ序列差异程度基本小于2%，绝大部分低于1%。Borisenko[9]、NicolasV]对哺乳动物（包括鼠科）的研究中，种内平均遗传距离基本小于2%，均与Hebert的研究结果一致。本研究中我们通过脊椎动物COⅠ通用鸡尾酒引物，对蒙古旱獭鼠疫自然疫源地内的啮齿动物6种75个样本的COⅠ基因进行序列分析，发现种内平均遗传距离为0.1%，种内最大遗传距离为0.6%，略低于别人的研究结果。

图1基于K2P模型构建的NJ进化树

Hebert研究发现93.8%的脊椎动物用COⅠ同样的基因区段，同属种间的遗传距离为4到32%，平均为9.6%。2009年EatonMJ对中非和南美的脊椎动物研究发现同属种间的平均遗传距离为9.8%，Borisenko[9]和NicolasV研究的哺乳动物其种间平均遗传距离分别为10.1%和11.2%。本研究发现种间平均遗传距离的为22.63%，大于种内平均遗传距离37倍之多，其种间遗传距离略大于其他人的研究结果，造成该现象的原因可能是由于本文中所选的6个品种分属于5个不同的属，种间距离其实大部分是代表不同科间的遗传距离。

本研究测定了蒙古旱獭疫源地常见6种啮齿动物的COⅠ基因657bp的多变区，基本包括该疫源地常见鼠疫宿主动物，每种动物都有自己单独的条形码，这为品种鉴定提供了有力的证据，不同位点上突变频率不同，每种啮齿动物有其特异位点，而且6个品种被分为各自不同的类群，能清楚的区分6个不同的品种，因此，应用DNA条形码基本可以鉴定蒙古旱獭疫源地的啮齿动物，同时可为形态鉴别提供佐证数据。同时可以发现蒙古旱獭疫源地啮齿动物的分布情况，近年黄鼠为优势种。但本实验涉及的品种以及个别品种测序的样本数量还相对较小，更可靠的结果有待于扩大实验品种范围及数量进行分析。

参考文献：

[1].方喜业.中国鼠疫自然疫源地[M].人民卫生出版社，1990：106-108.

[2].范蒙光，尉瑞平，李建云，等.内蒙古鼠疫自然疫源地啮齿动物现况调查[J].医学动物防制.2013，29（1）：5-9.

[3].JudithH.Robins，MelanieH，ElizabethMatisoo-smith，etal.IdentifyingRattusspeciesusingmitochondrialDNA[J].MolEcolNotes，2007，7（5）：717–729.

[4].IvanovaNV，ZemlakTS，HannerR，etal.UniversalprimercocktailsforfishDNAbarcoding[J].MolEcolNotes，2007，7（4）：544–548.

[5].HebertPDN，CywinskaA，BallSL，etal.BiologicalidentificationsthroughDNAbarcodes[J].ProcBiolSci，2003，270（1512）：313-321.

[6].HebertPDN，PentonEH，BurnsJM，etal.Tenspeciesinone：DNAbarcodingrevealscrypticspeciesintheneotropicalskipperbutterflyAstraptesfulgerator[J].ProcNatlAcadSciUSA.2004，101（41）：14812-14817.

[7].HebertPDN，RatnasinghamS，deWaardJR，etal.Barcodinganimallifecytochromecoxidasesubunit1pergencesamongcloselyrelatedspecies[J].ProcBiolSci.2003Aug7；270Suppl1：S96-99.

[8].HebertPDN，StoeckleMY，ZemlakTS，etal.IdentificationofbirdsthroughDNAbarcodes[J].PLoSBiol，2004，2（10）：e312.

[9].BorisenkoAV，LimBK，IvanovaNV，etal.DNAbarcodinginsurveysofsmallmammalcommunities：afieldstudyinSuriname[J].MolEcolResour，2008，8（3）：471-479.

[10].NicolasV，SchaefferB，MissoupAD，etal.Assessmentofthreemitochondrialgenes（16S，Cytb，CO1）foridentifyingspeciesinthePraomyinitribe（RodentiaMuridae）[J].PLoSOne.2012，7（5）：e36586.

[11].EatonMJ，MeyersGL，KolokotronisSO，etal，Barcodingbushmeat：molecularidentificationofCentralAfricanandSouthAmericanharvestedvertebrates[J].ConservGenet，2010，11（4）：1389–1404.

基金项目：2012年卫生公益性行业科研专项（201202021），内蒙古自治区卫生和计划生育委员会2013年医疗卫生科研计划项目（201302039）。

作者简介：常子丽（1980-），女，主管技师，博士，从事地方病防治工作。