6-羟基多巴定向注射建立帕金森病大鼠模型及MRI成像分析

6-羟基多巴定向注射建立帕金森病大鼠模型及MRI成像分析

王诚姜晨

王诚姜晨(南京医科大学附属无锡市人民医院神经外科江苏无锡214023)

【摘要】目的：建立简单、易行、成功率高的偏侧帕金森病大鼠模型。方法：SD大鼠80只，注射同等剂量的6-羟基多巴胺（6-OHDA）于内侧前脑束不同部位。位点1：前囟后1.8mm、右侧2mm、硬膜下8.5mm；位点2：前囟后1.8mm、右侧2mm、硬膜下7.5mm，制作黑质完全损伤型PD大鼠模型，运用阿朴吗啡诱发旋转试验及免疫组化检验模型是否成功。磁共振活体检测PD大鼠黑质、纹状体的毁损情况。结果：注射6-OHDA后第4周内有54只大鼠诱发明显的旋转行为，且旋转次数>7转/min，模型成功率为75％。MRI显示模型大鼠第1周后毁损侧黑质较对侧出现了明显的MRI低信号区，且随着时间的延长低信号区逐渐减小，至第3周已基本消失。结论：应用6-OHDA小剂量两点毁损内侧前脑束制备的偏侧帕金森病大鼠模型具有较高的成功率，是帕金森病研究较为理想的模型。MRI扫描可以活体连续观察帕金森病大鼠模型的毁损情况，是客观评价和检测帕金森病大鼠模型的一种有效工具。

【关键词】6-羟基多巴磁共振帕金森病

【中图分类号】R445【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）26-0028-03

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种常见的以中脑黑质多巴胺能神经元特征性缺失为主要病理改变的中枢神经系统变性疾病，目前确切的病因不明。建立稳定且科学的能模拟人类帕金森病病理学和行为学改变的PD动物模型，能为揭示帕金森病的确切病因、帕金森病药物疗效观察、细胞移植治疗以观察神经元再生和功能恢复情况提供了条件和实验依据。

6-羟基多巴胺（6-hydroxy-dopamine，6-OHDA）是制作偏侧帕金森病动物模型常用的神经毒剂[1]。由于结构与多巴胺(Dopamine，DA)类似，常被误作为递质摄入到多巴胺能神经元内，通过形成羟自由基和抑制线粒体氧化呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ，干扰ATP合成，选择性引起多巴胺能神经元死亡[2]。目前制造PD动物模型主要将6-OHDA立体定向注入单侧黑质、前脑内侧束（medialforebrainbundle,MFB）或纹状体内。本研究采用前脑内侧束注射法来制作黑质完全毁损型PD大鼠模型，并进行MRI扫描分析,为研究帕金森病提供可靠稳定且科学的动物模型。

材料与方法

实验动物健康成年Spague-Dawley(SD)大鼠80只,体重220～260g，由苏州大学实验动物中心提供。

主要试剂和仪器6-OHDA（Sigma公司）、阿朴吗啡（Sigma公司），TH小鼠抗大鼠单克隆抗体(Chemicon)，KOPF脑立体定向仪（KOPF公司），微量注射控制仪（WPI公司），10μl显微注射器（上海安亭微量进样器厂），PhilipGYROSCAN0.5T超导型磁共振。

帕金森病动物模型的建立取SD大鼠，腹腔注射3.6%水合氯醛（1ml/100g体重）麻醉，将大鼠固定在立体定向架上，以前囟为基准点，参照GeorgePaxinos所著大鼠脑立体定位图谱[3]，确定右侧前脑内侧束坐标位置，即：前囟后1.8mm，中线旁开2mm，硬膜下8.5mm、7.5mm，门齿钩平面比外耳道连线低（耳杆尖中心连线）2.4mm。取10μl微量注射器，吸取6-羟基多巴液（6-HODA，10mg加入5ml含0.01%抗坏血酸的生理盐水中，溶解混匀，配成0.2%的溶液）8μl。在5分钟内缓慢推注6-HODA液，留针2分钟，而后缓慢地出针，依次进行二点注射。

PD大鼠行为学观察注射6-HODA后第2、4、6周在同一安静环境下进行阿朴吗啡诱发旋转试验。以1mg/kg体重的剂量注射阿朴吗啡于大鼠腹腔，观测大鼠的旋转行为，成功模型在注射药物后1～10min内出现旋转，动物旋转时以健侧后肢为支点原地旋转，身体环曲，首尾相接360°为1转。注射10min后开始记录，计数30分钟内旋转次数，从而计算平均每分钟转数。旋转速度≥7次/min为成功模型[4]。

MRI动态观察采用苏州大学附属第二医院PhilipGYROSCAN0.5T超导型磁共振，T2WI横断位平扫。注射6-HODA后第1天、7天、3周、5周进行。

免疫组织化学染色注射6-HODA后第3天，旋转试验结束一周内各任取PD模型大鼠8只。取中脑、纹状体冰冻切片行TH免疫组织化学染色。

统计学处理数据均用SPSS10.0统计软件处理。实验数据采用均数±标准差表示，组间资料比较用方差分析，以P＜0.05为有统计学差异。

结果

阿朴吗啡旋转试验皮下注射阿朴吗啡后2分钟左右，大鼠即开始向损伤对侧（本实验为左侧）旋转，大鼠大多以旋转侧后肢为支撑点，原地转动，头尾相接。第四周后模型合格54例，成功率75%。

磁共振成像PD大鼠术后当天可见毁损侧针道周围较对侧出现了明显的MRI低信号区，随时间延长低信号区逐渐减小，在一周内基本消失，为手术创伤所导致的出血水肿带（见图1）。PD大鼠纹状体在术后一周后MRI扫描未出现明显信号变化。

图1.PD大鼠模型术后1天（左上）,七天（右上）,3周（左下）,5周（右下）纹状体MRI扫描。

PD大鼠术后一周后可见毁损侧黑质较对侧出现了明显的MRI低信号区，随时间延长低信号区逐渐减小，在三周左右基本消失（见图2）。

图2.PD大鼠模型术后1天（左上）,七天（右上）,3周（左下）,5周（右下）黑质MRI扫描。

假手术组大鼠在术后一周内在毁损侧针道处可见穿刺引起的MRI低信号区，毁损侧黑质MRI扫描无信号变化。

TH免疫组化结果TH免疫组化染色显示正常侧（左侧）中脑黑质TH阳性细胞密集，呈带状分布，胞浆浓染，发出细长的突起；毁损侧（右侧）在手术3天后中脑黑质TH阳性细胞显著减少，3周后已几乎完全缺失，着色淡；毁损侧（右侧）纹状体术后3周TH阳性细胞也几乎完全缺失（见图3、4、5）。

图3：正常SD大鼠黑质（左图）与帕金森模型大鼠健质黑质（右图）TH免疫组化染色无显著差异（X100）。

图4：帕金森模型大鼠术后3周（左图）与术后3天（右图）毁损侧黑质TH免疫组化染色（X100）。

图5：帕金森模型大鼠毁损侧纹状体（左图）与健侧纹状体（右图）TH免疫组化染色（X200）。

讨论

由于帕金森病的发病机制不明，因此就有必要建立可靠稳定的动物模型来进行研究。6-OHDA和MPTP是制作偏侧帕金森病动物模型常用的神经毒剂。MPTP常被用来制造小鼠及猴的PD模型，但其所致损伤的动物多巴胺能系统的功能常能自我恢复，且MPTP对大鼠不敏感[5]。自从1968年Ungerstedt等[6]首先利用6-OHDA制作成功PD动物模型以来，6-OHDA单侧损毁制备的旋转模型是目前用得最多的PD模型之一，其病理、生化方面的表现同人类PD有不少相似之处，如黑质DA能神经元变性、死亡、缺失，胶质细胞增生，黑质和纹状体TH活性及DA含量降低。另一突出的优点是药物诱发的旋转行为的量化，是评价PD模型成功以及治疗效果稳定可靠的指标。由于该模型属急性损伤模型，不能模拟PD慢性进行性病程特点，病理方面也与人类PD有一定差异（如无细胞内Lewy小体），因此可用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经保护治疗方面的研究。

目前制作PD动物模型主要用6-OHDA立体注入单侧黑质、前脑内侧束（medialforebrainbundle,MFB）、中脑被盖腹侧区（ventraltegmentalarea，VTA）或纹状体内。双侧损毁模型因为死亡率很高，现在已经很少应用。依据实验目的制作部分损伤PD大鼠模型或完全损伤PD大鼠模型。

前脑内侧束主要起始于腹侧被盖区DA能神经元，部分纤维终止于纹状体，邻近黑质纹状体DA能神经通路。考虑到黑质体积较小，呈长条形，注射比较困难，因此，本研究采用前脑内侧束注射法来制作黑质完全毁损型PD大鼠模型。通过一针道二位点注射，PD模型成功率为75％，高于文献报道的40-70％成功率[4,7]，也减少了模型大鼠颅内感染出血的机会。

大鼠PD模型成功的可靠标志是动物的行为学变化，主要通过以下几种试验：爪回缩试验、开放场地试验、步态调整试验主要用来测试大鼠的运动不能、肌僵直等[8]；楼梯实验和滚筒实验主要用测试大鼠的运动控制能力[9]；水迷宫实验主要用来测试大鼠的认知反应[10]。而确定大鼠PD模型成功最关键实验是旋转实验[4]。

PD大鼠单侧多巴胺能神经元损毁后，通过外周给予促DA制剂可使动物产生旋转行为。DA受体激动剂(如阿朴吗啡、溴隐亭等)可引起动物向健侧旋转，这是因为损毁侧黑质-纹状体DA系统破坏后，突触后膜的DA受体因失神经支配而敏感性增高，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。与此相反，若给予促DA释放制剂(如苯丙胺)则使动物向损毁侧旋转，因为损毁侧神经末梢可供释放的DA含量远低于健侧，因而健侧DA效应占优势。研究证实，黑质-纹状体系统的损毁程度与阿朴吗啡等药物诱导后大鼠的旋转圈数呈正相关[11]。当该系统轻度损毁时，纹状体系统内残留的DA能神经元合成和释放DA的能力增强，这对纹状体DA有明显的代偿作用。应用DA受体激动剂阿朴吗啡后，大鼠不出现旋转行为。当纹状体DA下降超过80％时，这种代偿作用丧失，损毁侧纹状体的突触后多巴胺D2受体超敏且数量增加，导致两侧多巴胺受体不平衡，应用阿朴吗啡后大鼠出现不对称性的向健侧旋转行为。因此，旋转行为的出现及频率成为鉴定模型成功和损毁程度的一个重要标志[12]。

酪氨酸羟化酶(TH)在中枢主要分布于儿茶酚胺能神经元内。在脑内TH催化儿茶酚类神经递质体内生物合成的起始步骤即L-酪氨酸羟化形成L-多巴的反应。与参与儿茶酚胺合成各步骤的其它酶相比，TH含量最少，合成速率最低，催化活性最弱，且底物专一性最强，因而被认为是包括多巴胺在内的儿茶酚胺合成的限速酶[13]。因此TH常被用来作为脑内多巴胺能神经元的标志酶。TH免疫组化可显示DA能神经元胞体及其突起。本研究对PD大鼠纹状体及黑质区进行TH免疫组化染色，发现6-OHDA注射侧TH免疫反应阳性细胞较对侧显著减少，进一步验证了PD大鼠模型的可靠性。

应用高分辨率MRI装置可在活体状态下连续观察PD模型内部的改变，有助于观察帕金森病大鼠模型的发病进展，进而客观评价和检测帕金森病大鼠模型。本实验利用MRI对大鼠术后1天至5周进行活体连续观察。毁损组PD大鼠第1周毁损侧黑质较对侧出现了明显的MRI低信号区，说明PD大鼠黑质MRI低信号区由于6-OHDA对神经元急性严重损伤作用引起的。随着时间的延长毁损组PD大鼠黑质MRI低信号逐渐减少，说明黑质多巴胺能神经元发生退变死亡同时，伴随有小胶质细胞与星形胶质细胞显著增生[19]。研究表明应用6-OHDA小剂量两点毁损内侧前脑束制备的偏侧帕金森病大鼠模型具有较高的成功率，是帕金森病研究较为理想的模型。MRI扫描可以活体连续观察帕金森病大鼠模型的毁损情况，是客观评价和检测帕金森病大鼠模型的一种有效工具。

参考文献

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