bFGF在实验性糖尿病大鼠结状神经节中的作用及该神经节超微结构的研究

bFGF在实验性糖尿病大鼠结状神经节中的作用及该神经节超微结构的研究

高尚1丁丽宏2李筱贺1王志强1马界荣1张琪1

高尚1丁丽宏2李筱贺1王志强1马界荣1张琪1（1内蒙古医科大学基础医学院解剖教研室010051；2内蒙古医科大学附属医院010051）

【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）50-0206-03

【摘要】目的探讨bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）在糖尿病神经病变（DNP）中的作用，为临床提供糖尿病神经病变的形态学依据。方法所有大鼠给予链脲佐菌素（STZ）60mg/kg腹腔注射，72小时后测尾静脉血糖，血糖≥16.7mmol/L且稳定2周以上者纳为糖尿病模型。在电子显微镜下观察结状神经节超微结构，用免疫组织化学的方法检测bFGF的表达。结果电子显微镜下发现糖尿病神经病变时细胞胞质内线粒体肿胀、溶解、嵴断裂；高尔基体成熟面肿胀；内质网肿胀，明显扩张。细胞核内内质网明显扩张，尼氏体边集。糖尿病大鼠较正常对照组大鼠结状神经节细胞胞浆bFGF表达增强。结论糖尿病时大鼠结状神经节超微结构发生变化，胞浆bFGF表达增强，可能是机体的一种抗损伤反应，bFGF对糖尿病神经病变时的神经元具有修复作用。

【关键词】大鼠糖尿病神经病变超微结构碱性成纤维细胞生长因子

糖尿病（DM）是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗所致的一组代谢性疾病，并发症可影响全身重要器官。糖尿病神经病变（DNP）是糖尿病最常见的并发症以及是病人致残的主要原因之一，出现时间较早，给病人带来极大的痛苦，严重影响患者的生活质量和危及生命健康[1]。碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF），是一类多功能的多肽生长因子，它与神经系统的生长发育有十分密切的关系。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能促进体外培养大鼠海马、皮层隔、丘脑神经元的存活和突起的生长，以及脊髓神经元（鸡胚）的存活[2，3]。在病理情况下细胞因子的异常表达多与系统或器官疾病的产生、发展密切相关。本实验通过对糖尿病大鼠结状神经节形态结构的观察，检测结状神经节中bFGF的表达，探讨细胞因子bFGF对糖尿病周围神经系统功能障碍的发生、发展的影响，为糖尿病周围神经系统功能障碍的发病机制和治疗提供一定的形态学理论依据。

1.材料与方法

1.1实验动物模型及分组

选用雄性健康SD大鼠25只，体重160g-180g，随机分为2组，对照组10只，模型组15只。将链脲佐菌素溶解于0.1MPH=6.0枸橼酸盐缓冲液，配成2%新鲜的链脲佐菌素（STZ）溶液，滤菌器除菌，以60mg/kg剂量一次性腹腔注射。正常对照组用等量生理盐水腹腔注射。选择注射STZ后72小时尾静脉取血测血糖，血糖≥16.7mmol/l，尿量以及饮水量明显增多者列入糖尿病实验大鼠模型，本组有13只造模成功。期间动物统一笼养，喂以基础饲料，自由进水，不进行胰岛素注射治疗，每两周测体重和血糖。

1.2标本收集及检测方法

饲养8周后所有的大鼠称取体重，均禁食水10小时，尾静脉取血测血糖。动物处死前5%乌拉坦腹腔注射麻醉（1.0ml/100g体重）。在颈部正中线处，作4cm切口，借助外科手术显微镜，找出左右侧颈动脉鞘，并仔细分离出迷走神经，至颅底颈静脉孔即迷走神经离开颅腔处，立即取左侧结状神经节制备电镜标本，右侧结状神经节固定于4%多聚甲醛中固定,常规脱水、石蜡包埋、切片,采用免疫组化染色,观察结状神经节bFGF表达(bFGF试剂盒购于Sigma公司)。细胞质内见染成棕黄色颗粒的结状神经节细胞,认定为表达阳性细胞。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统,在400倍视野下每张切片取5个视野,测定平均灰度值作半定量分析,用以反映其蛋白表达水平。

1.3.统计学分析

采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,所有数据均用-x±s表示,对所测结果进行正态性及方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析。

2.结果

2.1实验组大鼠注射药物后，整体状态差糖尿病大鼠组较正常对照组明显体重减轻，大鼠出现多尿、多饮、多食症状,行动迟缓，精神萎靡不振、体毛发黄、稀疏、掉毛，反应迟缓等症状,血糖值与正常对照组比较维持在（>16.7mmol/l）水平（体重及血糖见表1和表2）。

表1对照组与糖尿病组体重（克）值比较

组别0周2周4周6周8周

对照组179.17±9.25226.60±11.15282.08±13.89340.40±16.02422.92±13.73

糖尿病组175.50±13.43187.50±11.84204.50±11.66216.00±16.96203.00±18.29

与正常对照比较P＜0.01

表2对照组与糖尿病组血糖值（mmol/l）比较

组别0周2周4周6周8周

对照组5.54±0.615.96±0.685.33±0.865.15±0.365.56±0.69

糖尿病组22.50±3.4321.93±3.9825.00±2.0823.98±4.7824.30±1.54

与正常对照比较P＜0.01

2.2结状神经节电镜结果

电子显微镜下正常对照组大鼠的细胞核，呈规则的圆形或椭圆形，核内颗粒均匀一致，核仁清晰可见，着色深。细胞质内有大量的细胞器：大量的尼氏体（合成蛋白质的场所）；线粒体数量较多，呈圆形或椭圆形，嵴呈板状或管状，基质内颗粒较少；高尔基复合体比较发达，常由扁平囊、光滑小泡、有衣小泡和大泡组成；高尔基复合体附近有很多的溶酶体；可见有大小不等的，形状不规则的脂褐素颗粒（图1）。糖尿病大鼠组的细胞核不规则，有伪足伸出，核仁可见。细胞质内细胞器减少：膜较清楚，肿胀变性，嵴断裂、溶解，内部结构不清；内质网肿胀，核糖体有脱落现象；高尔基复合体成熟面肿胀；神经原纤维数量增多，肿胀，体积增大（图2）。

图1正常对照组图2糖尿病组

大鼠结状神经节神经元（1×21000）

2.3免疫组化结果

细胞质内见染成棕黄色颗粒的结状神经节细胞,认定为表达阳性细胞。对照组大鼠结状神经节细胞胞浆内有散在的黄褐色颗粒，呈弱阳性反应；糖尿病大鼠组结状神经节细胞胞浆内出现黄褐色块状物质，呈强阳性反应（图4）。bFGF平均积分光密度值(IDP)测定见表3。

图3正常对照组图4糖尿病组

大鼠结状神经节bFGF免疫组化染色

表3对照组与糖尿病组bFGF的IDP值比较

组别IDP值p值

对照组17.96±3.480.00

糖尿病组22.88±3.98

与正常对照比较*P＜0.01

3.讨论

糖尿病的慢性并发症有糖尿病神经病变（DPN）、糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病等。神经病变中既可影响周围神经系统，又可影响中枢神经系统。DPN可累及感觉神经、运动神经和自主神经,但以感觉神经最为常见[4]。神经病变发病机制已知并非单一因素所致，有些学者认为神经营养因子、免疫因素等也起作用。

bFGF作为一种重要的促进有丝分裂的蛋白质分子（多肽），广泛分布于脑、心、肝、骨、眼、肾上腺、胎盘等组织中。bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用[5]。关于bFGF在中枢神经，发现其神经活性广泛，能保护神经元，促进突起增生，提示在周围神经再生方面的研究意义。bFGF是少突胶质细胞、Schwann细胞和星形胶质细胞有效的有丝分裂原，能促进各种胶质细胞和神经元前体细胞的增殖和分化[6]，并诱导神经生长因子（NGF）受体的表达，并使细胞的存活依赖于NGF；bFGF可维持神经元的存活、促进神经元分化；对中枢和周围的神经元的损伤有保护和再生作用。中枢与外周神经损伤后，局部bFGF的产生和分泌增加，并可引起一系列的生物学效应，如促进神经节细胞增殖，神经元突起生长以及防止神经元胞体死亡，说明体内神经元的损伤与修复需要bFGF存在。bFGF的作用机制有两种：内源性bFGF的释放途径；bFGF与受体结合的方式[7]。

本文采用免疫组化的方法观察了大鼠结状神经节中神经元bFGF的表达以及分布情况。结果表明糖尿病组和正常对照组结状神经节神经元胞浆中都有bFGF的表达，但糖尿病大鼠组表达强度明显高于正常对照组（P＜0.01）；电子显微镜显示糖尿病大鼠节状神经节的神经元有损伤表现，说明bFGF在糖尿病大鼠节状神经节的神经元中高表达，可能对神经元营养以及再生有作用。

神经生长因子（NGF）是交感神经元﹑感觉神经元和中枢神经胆碱能神经元神经元生长、发育、存活、维持功能所必须的营养因子[8]。NGF对效应神经元的作用主要有：①影响效应神经元的发育、分化过程；②维持成熟效应神经元正常功能；③参与成年动物效应神经元损伤后的修复与再生[9]。在神经系统发育早期，bFGF参与神经元前体细胞增殖和最初分化，并起到级联控制过程。在神经祖细胞发育成神经元的过程中，首先受bFGF的作用，诱导NGF受体的表达，并使细胞存活依赖于NGF。本实验也发现，糖尿病神经病变时，确实存在神经元的损伤。而糖尿病神经病变时，大多数实验研究发现NGF的水平是下调的，原因是NGF的生成是减少的以及NGF受体的功能是异常的[10]。因此我们是否可以推测，bFGF表达增强可能是因为NGF的水平是下调导致的。

bFGF及其受体在周围神经的表达和损伤后变化的研究说明，与在中枢神经系统内，内源性bFGF表达增多同样是外周神经损伤后的早期反应[11]。有些学者将bFGF应用于神经细胞的培养和神经损伤模型等实验，发现bFGF具有广泛的促神经再生作用，提示bFGF表达增多是神经损伤后的修复反应，且可能具有始动意义。而对于动物实验，现在大部分学者集中于对神经干的研究，本实验从神经元的角度，利用bFGF在神经细胞内的表达强弱，探讨了糖尿病时神经病变，为糖尿病神经病变的机制提供形态学依据。同时，是否可根据bFGF在神经元细胞内表达程度的高低，来判断糖尿病中神经元损伤程度，进一步判断糖尿病神经病变范围，有待探讨。

本实验结状神经节位于迷走神经干上的一个膨大，其中的神经元为假单极神经元，周围突组成迷走神经中的感觉纤维成分，主要分布于头、颈、胸、腹腔脏器；中枢突向脑投射。本实验从神经元的水平探讨了糖尿病神经病变的机制，那么神经元的损伤是否会引起神经干及其相连的效应器或感受器的损伤，还是在糖尿病时，三者是互相影响的，需要进一步探讨。

bFGF作为一种具有广泛生物学活性的生长因子和神经营养因子，随着bFGF研究的深入，可能给糖尿病神经病变的发病机制提出新的问题，给治疗带来新的希望。

参考文献

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