犬脂肪干细胞在犬皮肤创伤修复中的作用

犬脂肪干细胞在犬皮肤创伤修复中的作用

李平洋

贵州省人民医院，贵州550001

摘要：本研究对五只犬进行直径三厘米的皮肤全层切除从而建立创伤模型，创伤局部注射经Dil荧光染料染色的异体脂肪干细胞，与未注射脂肪干细胞的对照组进行对照，从伤口愈合状况，伤口愈合率及愈合时间，肉芽组织的组织学切片观察，新生皮肤组织冰冻切片荧光显微镜观察等方面进行评价，结果表明犬异体脂肪干细胞创伤局部注射后，犬没有表现出不良反应，注射部位无异常；五只犬中三只试验组愈合速度快于对照组，上皮化时间较早，一只无差别，另一只试验组慢于对照组；肉芽组织切片观察，试验组新生血管密度高于对照组，且胶原纤维更加丰富；试验组新生皮肤组织中发现红色荧光散在存在于真皮上部，对照组未见红色荧光存在。

研究结果表明，犬异体脂肪干细胞可减少炎症反应，促进犬皮肤创伤愈合速度，提高肉芽组织中新生血管密度，增加胶原纤维的分泌量，并且可存在于新生的皮肤组织中。

关键词：脂肪干细胞；创伤；愈合，组织切片

1前言

脂肪组织来源的干细胞(Adipose-DerivedStemCells，ADSCs)，最早是由Zuk等通过脂肪抽吸法获得的一种纤维样的细胞成分，经免疫荧光和流式细胞仪器检测，发现其主要来源于中胚层与间叶，并证明其具有类似干细胞样的多向分化能力，使这种原本不太受欢迎的脂肪物质有可能成为干细胞库的重要来源，并可作为多种组织工程的种子细胞，使其具有非常重要的研究和应用价值。创伤愈合是一个复杂的过程，它需要经过细胞迁徙和增殖、细胞外基质沉积、血管再生和组织重构等一系列复杂的生物和分子水平改变共同作用完成。

脂肪干细胞由于其获取方便，具有多向分化能力且体外增殖能力强，近年来在创伤愈合和组织修复过程中的作用日益受到研究者的重视。本研究为犬同种异体脂肪干细胞在犬皮肤全层创伤愈合中的作用，以便其在小动物临床治疗应用中提供一定的试验支持。

2材料与方法

2.1试验动物

供体犬选自某高校动物医院手术室进行生理性绝育手术的成年健康母犬。试验犬为该高校动物医院研究用犬，经过临床检查和特殊检查确定健康。

2.2主要试剂与器材

I型胶原酶、0.25胰蛋白酶、DMEM培养基、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、组织切片机、冰冻切片机、荧光显微镜

3试验方法

3.1脂肪干细胞的获取及标记

供体试验犬麻醉，于腹腔镰状韧带切取脂肪组织，超净台中胶原蛋白酶消化、过滤、培养，细胞传至第三代时，使用Dil荧光染料对脂肪干细胞进行标记。

3.2试验犬皮肤创伤模型的建立

选取五只健康的试验犬，分别于犬的肩胛部、臀部两侧，分别做直径三厘米的皮肤创口，左侧作为试验组，右侧作为对照组。

3.3脂肪干细胞的注射

左侧试验组创口平均分四点，皮下注射含标记脂肪干细胞的DMEM液，右侧对照组同样方法注射无脂肪干细胞的DMEM液，创口按常规创伤处理方法进行处理。

3.4创伤的评估

注射脂肪干细胞后，每天对创面愈合情况、创面面积进行记录，记录创面愈合时间，18天时取新生肉芽组织进行组织学观察，创面完全愈合后取新生皮肤组织做冰冻切片荧光显微镜观察。

4试验结果

4.1犬局部注射脂肪干细胞后创面的观察

五只犬在局部注射脂肪干细胞后，一周之内对其注射部位跟踪观察，注射部位都无红肿热痛等不良反应，犬只本身也无明显的不适反应，吃喝等均正常；

对研究犬伤口观察发现，五只犬在前一周时间内炎症反应表现明显，伤口处都有淡黄色炎性物质存在，但试验组伤口炎性物质较右侧相对较少；第二周到第四周时间段，伤口处被新生的肉芽组织所覆盖，伤口清洁，试验组在肉芽组织生长速度方面快于对照组，肉芽组织较早填满伤口；第四周至伤口愈合时间段，伤口在形成肉芽组织的基础上开始明显上皮化，主要表现从伤口四周向中央形成新鲜上皮，试验组开始上皮化时间早于对照组。

4.2犬皮肤创伤愈合时间及其愈合率

本研究中，四只试验犬其试验组伤口完全表皮化早于对照组伤口，提早时间平均为一个周，另一只犬伤口愈合时间试验组较对照组延长六天。

对五只犬的创面面积每天进行测量，绘制出其伤口愈合率变化趋势表，并得出如下结果：

试验组与对照组皮肤创伤愈合过程中，其愈合率随愈合时间的变化曲线都呈现“S”型。第一周愈合速度较慢，第二周至第三周创口愈合速率达到最快，第四周至完全愈合伤口愈合速度逐渐变缓。

1、2、3号三只研究犬在注射脂肪干细胞后，伤口开始愈合时间试验组早于对照组，同时其愈合率自始至终超过对照组，愈合率差距最大的时期在第二、三周时期(P＜0.05)，即伤口缩小最快时期，二者差距保持在10%以上，其它时期差距较小，在2%-5%之间。4号犬研究面与对照面愈合率基本保持一直，无明显差别，但完全上皮化时间试验组早于对照组5天；5号犬试验组伤口缩小时间早于对照组，在开始一个周时愈合率超过对照组，随后对照组超过试验组，二者愈合率交替增长。

4.3组织学观察新生肉芽组织

取试验组和对照组新鲜肉芽组织，对其进行常规组织切片及HE染色，于光学显微镜下进行组织学观察发现：肉芽组织中新生的毛细血管，试验组较对照组中血管密度更大（P＜0.05）；肉芽组织中，试验组胶原纤维数量多于对照组，且排列顺序较对照组更加有序。

4.4冰冻切片观察新生组织中标记的ADSCs

为了观察荧光标记的脂肪干细胞是否存在于新生的皮肤组织中，对新生组织进行冰冻切片并在荧光显微镜下观察，得出结果如下，每只犬的试验组新生皮肤组织中都观察到点状红光荧光分散在视野中，并且其主要分布于新生组织的中上部，而对照组不能观察到点状的红光存在，这与相关研究报道一致。

5结束语

本研究中，治疗犬皮肤创伤所使用的干细胞为同种异体脂肪干细胞，在对治疗犬进行一周的观察后，并未发现犬出现过敏等不良反应，所有犬吃喝精神等正常，局部注射部位也未见有红肿热痛等炎症反应，由此可见，在犬创伤治疗上使用同种异体脂肪干细胞具有一定可行性。目前，在脂肪干细胞对创伤治疗的相关研究中，大部分都使用的是自体脂肪干细胞，同种异体或异种脂肪干细胞治疗的相关研究相对较少，其最主要原因是担心使用异体干细胞会引起受体机体的免疫排斥反应。新近研究显示，脂肪干细胞在体外可以抑制淋巴细胞的增殖反应，具有一定的调节淋巴细胞反应的能力，表明脂肪干细胞不仅可以用于自体细胞移植，也可用于同种异体细胞移植。ADSCs应用于皮肤伤口，局限于损伤局部，没有向全身扩散，不会影响机体远位肿瘤的扩大和恶化，全身应用ADSCs显然是安全的，不会诱导肿瘤发生。

参考文献：

[1]尹玉鑫施振声曾申明.犬脂肪干细胞在犬皮肤创伤修复中的作用[J].犬业科技.2016(11)

[2]傅士博王雪温从吉等.脂肪干细胞在皮肤创伤修复中的研究进展与应用前景[J].中华损伤与修复杂志(电子版).2012(02)