干扰Birc6的表达增强结直肠癌细胞对5-FU敏感性的研究

干扰Birc6的表达增强结直肠癌细胞对5-FU敏感性的研究

马海滨1范恒2（通讯作者）

马海滨1范恒2（通讯作者）

（1宁夏医科大学总医院宁夏银川750004）

（2宁夏人类干细胞研究所宁夏银川750004）

【摘要】目的：探讨Birc6影响结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。方法：首先构建Birc6的腺病毒干扰表达载体，利用定量PCR及Westernblot的方法验证其干扰效率。将上述载体转染至人结直肠癌细胞系HCT116中，利用定量PCR检测自我更新相关基因（Oct4、Sox2和Nanog）的表达；另外，将转染后的细胞在含有不同浓度的5-FU培养液中培养48小时，利用MTT的方法测定细胞的生长抑制率。结果：在HCT116细胞系中敲低Birc6的表达，抑制了Oct4、Sox2和Nanog的表达水平（P＜0.05）；HCT116细胞系在含有不同浓度5-FU的培养液中培养48h后，敲低Birc6的表达增强了5-FU的细胞抑制率（P＜0.05）。结论：在HCT116细胞中敲低Birc6的表达，抑制了自我更新相关基因的表达并增强了其对5-FU的敏感性。

【关键词】结直肠癌细胞；Birc6；5-FU；敏感性

【中图分类号】R735.3【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2018）22-0196-02

结直肠癌是一种常见的高危害消化道恶性肿瘤，是发病率和致死率均居前列的常见恶性肿瘤，严重影响人们的生活质量。肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称之为肿瘤干细胞。近年研究表明，自我更新相关基因与肿瘤的侵袭、耐药及复发密切相关[1]。因而，研究肿瘤干细胞的特性对肿瘤的治疗至关重要。Van等人以结直肠癌细胞为对照，经过蛋白组学技术分析发现，在结直肠癌干细胞中Birc6呈高表达趋势[2]。

BIRC6（杆状病毒抑制凋亡结构域重复包含蛋白6）是最大的IAP（抑制凋亡蛋白）家族成员。该蛋白C末端存在着激活的泛素酶结构域，能抑制Caspase9的活性从而抑制细胞凋亡。但该基因与肿瘤细胞的自我更新还未见报道。因此，我们将探究Birc6是否影响结直肠癌细胞自我更新相关基因Oct4、Sox2、和Nanog的表达以及对其对化疗药物5-FU的敏感性。

1.材料和方法

1.1材料

人结直肠癌细胞系HCT116系本实验室保存。RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）购自GIBICO公司。Birc6抗体购自Abcam公司，GAPDH抗体、羊抗兔及羊抗鼠二抗购自中杉金桥公司。引物合成购自于英骏公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养：HCT116细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中常规传代培养。待细胞生长至约70%融合状态时用于实验。

1.2.2干扰腺病毒载体构建：根据Birc6编码序列设计干扰序列（5’-GGGCCAGTATGGCT-TGCTAGTA-3’），将两条反向互补的发夹序列退火后与pAdTrack-U6载体连接。然后与腺病毒骨架载体pAdEasy同源重组，并转染至293A细胞获取shBirc6腺病毒。

1.2.3Westernblot法检测shBirc6载体的干扰效率：收集转染腺病毒的两组细胞，漂洗后加入RIPA裂解液裂解，离心，收集总蛋白；将蛋白与上样缓冲液混合煮沸5min，进行电泳并转印至PVDF膜，经5%的脱脂奶粉封闭后，与Birc6和GAPDH抗体分别杂交，洗膜，孵育二抗，洗膜，显影。

1.2.4定量PCR检测shBirc6的干扰效率及Oct4、Sox2和Nanog的表达水平：用Trizol裂解细胞，提取总RNA，并进行逆转录反应后获得cDNA。利用SYBRGreen染料法进行定量PCR实验。

1.2.5MTT法检测干扰Birc6后的HCT116细胞对5-FU的敏感性：取对数生长期的两组细胞分别转染siSCR和siBirc6，在含有不同浓度的5-FU培养液培养48小时，测定每孔细胞吸光度（A值）。实验设空白组、对照组及药物实验组，空白组只加细胞培养液，对照组为细胞和培养液，实验组为分别转染siSCR和siBirc6并含有5-FU的细胞和培养液。最后计算细胞生长抑制率（%）=[（对照组-实验组）/（对照组-空白组）]×100%。

1.3统计学处理方法

采用SPSS16.0软件进行分析。数据采用x-±s表示，组间比较采用Student,st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1构建的shBirc6腺病毒载体能有效地抑制HCT116细胞内源性的Birc6的表达

在蛋白水平，构建好的shBirc6载体能强烈抑制HCT116细胞内源性Birc6的表达；定量PCR检测发现，转染shBirc6后，HCT116细胞内源性Birc6的抑制率达到62%。实验组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），所构建的shBirc6载体能抑制HCT116细胞内源性Birc6的表达。

图（A,B）转染shBirc6及shSCR后，HCT116细胞内源性Birc6的表达水平。

2.2干扰Birc6的表达可以抑制HCT116细胞自我更新基因的表达

定量PCR检测表明，干扰shBirc6表达后，HCT116细胞内源性的Oct4、Sox2和NanogmRNA表达水平的抑制率分别达到48%、42%及34%。实验组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），说明自我更新相关基因表达受到抑制具有显著性。

图（C）转染shBirc6及shSCR后，HCT116细胞内源性Oct4、Sox2和Nanog的表达水平。

2.3干扰Birc6的表达可以增强HCT116细胞对5-FU的敏感性

在浓度高于10uM的5-FU处理的条件下，与shSCR组细胞相比，敲低Birc6可以显著增强HCT116细胞对5-FU的药物敏感性（P＜0.5）。

图（D）转染shBirc6及shSCR后，不同浓度的5-FU对HCT116细胞生长的抑制率。

3.讨论

大量实验证明，在多种肿瘤中，如：胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌及非小细胞肺癌等，BIRC6呈高丰度表达。并且，BIRC6呈高丰度表达与肿瘤的发生、侵袭及不良的预后密切相关[3-4]。另外，前期文献也表明：肿瘤干细胞中高丰度表达的BIRC6与化疗药物的敏感性相关[5]。本实验表明，在HCT116细胞中敲低BIRC6的表达不仅能增强5-FU的药物敏感性而且抑制了自我更新基因的表达。那么本研究从BIRC6影响肿瘤干细胞的自我更新及耐药性的角度阐述其生物学功能为结直肠癌的临床治疗提供理论依据。

【参考文献】

[1]GwakJM,KimM,KimHJ,etal.Expressionofembryonalstemcelltranscriptionfactorsinbreastcancer:Oct4asanindicatorforpoorclinicaloutcomeandtamoxifenresistance[J].Oncotarget,2017,8(22):36305-36318.

[2]HoudtWV,EmminkBL,PhamTV,etal.ComparativeproteomicsofcoloncancerstemcellsanddifferentiatedtumorcellsidentifiesBIRC6asapotentialtherapeutictarget.[J].Molecular&CellularProteomicsMcp,2011,10(12):M111.011353.

[3]FiekeL,LindaS,JanK,etal.IdentificationofBIRC6asanovelinterventiontargetforneuroblastomatherapy[J].BmcCancer,2012,12(1):285.

[4]LowCG,LukISU,LinD,etal.BIRC6Protein,anInhibitorofApoptosis:RoleinSurvivalofHumanProstateCancerCells[J].PlosOne,2013,8(2):e55837.

[5]DongX,LinD,LowC,etal.ElevatedexpressionofBIRC6proteininnon-small-celllungcancersisassociatedwithcancerrecurrenceandchemoresistance.[J].JournalofThoracicOncology,2013,8(2):161-170.

宁夏医科大学校级课题，编号；XQ2011026XQ2012003