无血清培养基分离肺癌干细胞的应用

无血清培养基分离肺癌干细胞的应用

董慧君曾宪卓(通讯作者）鲁菲郭明辉张哲

董慧君曾宪卓(通讯作者）鲁菲郭明辉张哲

（深圳爱生再生医学科技有限公司广东深圳518057）

【摘要】肺癌是第一大常见恶性肿瘤，肺癌干细胞的研究为肺癌诊断和治疗带来新的契机。为更好了解肺癌干细胞以及研究靶向肺癌干细胞的肿瘤疗法，肺癌干细胞的分离鉴定显得尤为重要。无血清培养法已经是分离培养肿瘤干细胞的经典方法，也被广泛应用于肺癌干细胞的分离。本文综述了无血清培养基分离肿瘤干细胞的研究应用。

【关键词】肺癌干细胞；无血清培养基；分离

【中图分类号】R73【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）04-0197-02

肺癌目前是全球范围内癌症死因的第一位，据统计，每年肺癌死亡人数约130万例。尽管近年来手术、化疗、放疗以及生物治疗取得很大的进展，使得肺癌患者的生活质量得到显著提高，但是肺癌患者5年生存率仍低于15%。

肿瘤干细胞理论认为，肿瘤组织中有一小部分具有干细胞特性的特殊细胞亚群，即肿瘤干细胞(CancerStemCells,CSCs)，既有自我更新能力和多向分化的潜能，又具有致瘤性，能表达特异性细胞表面标志物，还具有高度耐药性，能抵抗传统放化疗杀伤作用，与肿瘤的发生、发展、复发和转移密切相关。目前，已在血液系统肿瘤如白血病，以及乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌等实体肿瘤中证实了存在肿瘤干细胞样亚群细胞。肿瘤干细胞理论的提出及进一步深入研究，无疑为基于肺癌干细胞的肺癌诊断和治疗带来新的希望。

1.肺癌干细胞

1.1肺癌干细胞的发现

2005年，Kim等从小鼠支气管和肺泡导管交界处分离到支气管肺泡干细胞(bronchoalveolarstemcells,BASCs)，经免疫荧光法和流式细胞仪筛选发现，BASCs是具有Sca-1+CD45-PE2CAM-CD34+特征的干细胞。BASCs具有自我更新能力，正常情况下处于静止状态，当体内支气管和肺泡损伤时，能够分化为终末细支气管上皮细胞（Clara细胞）、I型肺泡上皮细胞和II型肺泡上皮细胞，并且当K-ras基因突变活化时，观察可发现在终末支气管和肺泡上皮的不典型增生和腺瘤中，BASCs数量会发生明显的增加，提示BASCs可能是肺腺癌的起源细胞。这是具有划时代意义的一步，该报道证明了肺组织存在有肺癌干细胞。随后，陆续有文献报道从肺腺癌、小细胞肺癌细胞株发现干细胞样细胞。

1.2肺癌干细胞的分离

肺癌干细胞研究的焦点是其分离和鉴定，目前采用的方法是公认的CSCs的分离方法：细胞表面标志物分选法、侧群细胞（sidepopulation,SP）分选法以及无血清培养基（SFM）成球分离法。

SP分选法，从肿瘤干细胞的特性入手，依据肿瘤干细胞具有外排DNA荧光染料Hoechst33342的能力，从肿瘤细胞系或组织中分离出SP细胞，再利用流式细胞仪分选出SP。SP有肿瘤干细胞样性特性，但不是说SP就是肿瘤干细胞。此外，Hoechest33342对细胞的毒性也限制了它的进一步应用。

SFM成球分离法，利用在无血清条件培养基中添加特定的细胞生长因子，肿瘤干细胞呈干细胞球状悬浮生长，而分化程度较高的肿瘤细胞容易凋亡沉积。Reynolds等最早将SFM成球分离法引入神经干细胞研究，保证成体干细胞体外扩增的同时也维持了干细胞多向分化潜能，目前已在多种肿瘤研究中得到应用。此方法能够简单、快速的分离富集肿瘤干细胞。

2.无血清培养法分离肺癌干细胞的研究

肺癌细胞异质性明显，研究难度大，不同于乳腺癌、胶质瘤干细胞的迅速发展，远远落后于其他实体瘤。但是，借鉴其他肿瘤的研究方法，近年来，SFM成球分离法也被广泛应用于肺癌干细胞的分离，并取得了一定的进展。

自Eramo等应用SFM培养得到人肺癌干细胞后，先后有文献报道不同肺癌细胞株中SFM成球分离法的应用。月文科等采用SFM成球分离法对人大细胞肺癌细胞株L9981进行悬浮培养，获得肺癌细胞球体，结果显示L9981球体细胞中富集了肺癌干细胞样的细胞。通过特定的无血清培养小细胞肺癌SCLCH446细胞系，可以得到具有干细胞特性的肿瘤球，该肿瘤球体外克隆性、体内致瘤性以及药物抵抗性均增强。通过细胞表面标记物的分析，发现肿瘤球除了常见的CD133外，uPAR也高表达。将对小细胞肺癌的分离提供新的依据。Zhao等在无血清条件下培养非小细胞肺癌NSCLCA549细胞系，获得的肿瘤球更具侵袭性，并高表达干细胞标志物八聚体结合转录因子4(Oct4)、胚胎干细胞关键蛋白(Sox2)以及CD133。该肿瘤球体内致瘤能力高，且还能新生更多肿瘤血管，相比其他分离培养方法，通过无血清培养形成肿瘤球来富集干细胞更简单高效。

为获得富含肺癌干细胞的球体细胞，无血清培养基中可以添加不同的细胞生长因子进行诱导。研究发现，利用重组表皮细胞生长因子、重组胰岛素样生长因子1以及碱性成纤维细胞生长因子联合使用的方式诱导肺癌SPC-A1细胞群，获得相应的肺癌干细胞球体，经免疫荧光检测发现80%以上的球体细胞表达细支气管肺泡干细胞标志SP-C和CCSP，胚胎干细胞主干基因OCT4染色阳性，并且经小鼠移植实验表明球体细胞具有高致瘤性。说明肺癌干细胞在肺球体中高度富集。

3.结语

肺癌是世界上第一大恶性肿瘤，位居癌症死因第一位。肺癌干细胞的研究为肺癌的诊断和治疗提供了新的方向。无血清培养法是分离肺癌干细胞的有效方法，然而无血清培养得到的肿瘤球只是富含肿瘤干细胞，其中也含有非肿瘤干细胞，培养周期也比较长。如何分离得到数量多且纯度高的肺癌干细胞需要进一步研究，并最终明确真正的筛选标记以分离肺癌干细胞，从而更全面的认识肺癌干细胞的生物学特性及其在肺癌中的作用，为靶向肺癌干细胞的肿瘤疗法提供理论基础。

基金项目：科技部中小企业技术创新（13C26214424713）；深圳科创委战略新兴（深发改[2013]1450号）；深圳科创委战略新兴（深发改[2013]1891号）