人结肠癌总RNA转染树突状细胞介导个体化免疫治疗的体外实验

人结肠癌总RNA转染树突状细胞介导个体化免疫治疗的体外实验

王绛辉1李雪敏2许士珍3刘巧格1

王绛辉1李雪敏2许士珍3刘巧格1常红1马云龙4谢少建5

1河北省中医药研究院(河北石家庄050031)2邢台市疾病控制中心

3衡水市第四医院

4河北省中医院

5河北医科大学附属二院

【摘要】目的探讨转染自体肿瘤细胞总RNA的树突状细胞体外所介导的抗结肠癌免疫效应。方法制备短期培养的原代结肠癌细胞。用rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α体外诱导结肠癌患者外周血单个核细胞（PBMC）的DC发育和成熟，转染自体肿瘤细胞总RNA，激活自体T细胞产生CTL。应用流式细胞技术及混合淋巴细胞培养法检测DC的免疫功能状态；用CCK-8试剂盒检测活化CTL的杀伤活性；应用ELISA测定IL_12和INF_γ的分泌水平。结果转染自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC不仅高表达MHC_I、MHC_II类分子及CD80、CD83、CD86共刺激分子，并获得高效刺激自体或异体T淋巴细胞增殖的能力；转染RNA后成熟DC分泌IL_12水平以及其刺激产生的CTL上清液中INF_γ的浓度显著高于单纯成熟DC及未成熟DC；且CTL对自体结肠癌细胞杀伤率显著高于异体组。结论转染自体结肠癌细胞总RNA的成熟DC能够体外诱导产生对自体肿瘤细胞具有高度抗原特异性及杀伤活性的CTL。

【关键词】结肠癌树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞免疫治疗

项目来源:河北省中医药管理局科学研究计划项目(项目编号:2008108)。②作者简介:王绛辉(1970年-),男,主治中医师,主要从事中医临床研究。

［中图分类号］R656.9［文献标识码］A［文章编号］1810－5734(2010)12-0093-02

肿瘤的生物治疗近年来发展迅速。树突状细胞(DC)作为体内专职抗原提呈细胞（APC）在机体抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用［1，2］。研究表明，肿瘤细胞RNA转染DC可诱导抗肿瘤免疫反应［３］，但其作用机理尚不明确。我们通过观察转染结肠癌患者自体肿瘤细胞总RNA的成熟DC对免疫功能的调节作用，及抗原特异性CTL对原代培养的自体/异体肿瘤细胞杀伤效率的比较，进一步明确其作用机制，为临床开展个体化抗肿瘤免疫治疗提供依据。

1材料与方法

1.1试剂：RPMI1640培养基(GIBCO公司)；IL_12、INF_γELISA检测用试剂盒、重组人白介素_4(rhIL_4)、重组人粒单细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和TNF_α均购自英国PeproTechECLtd公司；淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Sweden)；CellCountingKit_8(CCK_8Kit)购自日本同仁株式会社。

1.2自体原代肿瘤细胞培养：短期培养的自体原代肿瘤细胞系WMCC1003、WMCC1004和WMCC1005分别来自3例男性结肠腺粘液腺癌患者（均行根治性结肠切除术）。依据文献［４］的方法筛选原代细胞系。

1.3自体肿瘤细胞总RNA的准备：取患者自体手术切除新鲜肿瘤标本200mg，按Run-out试剂盒使用说明常规提取RNA，分光光度仪测定0D260/0D280nm比值大于1.8,计算RNA总量并调整浓度为2.5g/L。经1%琼脂糖凝胶电泳见28S及18S两条带清晰完整。

1.4提取和培养自体DC：取患者外周抗凝血，PBS等倍稀释后移入预加Ficoll-Hypaque分离液的离心管中，1500转/min离心20min；取上层血浆0.22um滤膜过滤后备用；吸取单个核细胞,用含2mMEDTA的PBS洗涤3遍，移入塑料培养瓶中，加入含5%自体血浆的RPMI1640培养基静置培养2h，分离未贴壁细胞继续培养，贴壁细胞消化后以1×106/ml接种于6孔培养板；分别于3d、5d换液，第5d时将细胞分为两部分，一部分加入TNF_α10ng/ml，48h后收集呈悬浮细胞为成熟树突状细胞（mDC)，收集另一部分未加TNF_α的细胞作为未成熟树突状细胞（imDC）

1.5自体T淋巴细胞分离用miniMACS磁珠分选仪及HumanPanTCellIsolationKit，按试剂盒所示方法从非贴壁PBMC中分选自体T细胞，并用流式细胞仪检测FITC标记的CD3，鉴定T细胞的纯度。

1.6自体肿瘤细胞总RNA转染DC在培养5d的DC（1×106/ml）中以25g/L的浓度加入自体肿瘤细胞总RNA,经7d培养成已转染自体肿瘤RNA的mDC(RNA_mDC)。

1.7用RNA_mDC诱导产生CTL参照Shirley等方法并稍作改进［５］。将磁珠分离的自体T淋巴细胞等分为三组分别与imDC、mDC和RNA—mDC以40:1比例混合培养，收集CTL检测其对自体或异体原代结肠癌细胞的细胞毒性。

1.8DC细胞流式检测：分别收集imDC、mDC和RNA-mDC，调整细胞浓度为1.2×106/ml，分别依次加入20%封闭用兔血清、标有荧光素的不同单克隆抗体工作液，避光静置后各加入PBS100ul混匀后上机检测。

1.9淋巴细胞增殖实验（MLR）：取imDC、mDC和RNA-mDC与自体/异体T按E:T=5:1、10:1、20:1和80:1的比例混合后加入96孔培养板，每样本各设各3个复孔。37℃孵育96h，加入CCK-8试剂（20μl/孔）［6］，继续孵育3h后，用酶标仪在450nm波长测定各实验孔OD值。

1.10CTL活性检测：imDC、mDC和RNA-mDC诱导产生的CTL分别同自体和异体原代培养的结肠癌细胞按E:T=40:1、20:1和10:1的比例混合加入96孔培养板，每样本各设3个复孔。37℃孵育18h，加入CCK-8试剂（20μl/孔），继续孵育3h后，用酶标仪在450nm波长测定实验孔OD值，计算杀伤率。杀伤率(%)=(1-〖SX(〗实验组0D值—单纯效应细胞组0D值)单纯靶细胞0D值〖SX)〗)×100%

1.11细胞因子检测：取imDC、mDC和RNA—mDC组的培养上清液和各组DC诱导刺激产生的CTL上清液，按ELISA检测试剂盒操作说明检测各DC组中IL_12和各CTL组中INF_γ的含量。

1.12统计学方法：所有数据采用均值±标准差表示，经SPSS统计软件处理，两组比较用配对t检验，三组及三组以上的两两比较用单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1原代培养肿瘤细胞的形态学观察：原代培养的结肠癌细胞镜下观察呈梭形、片状或多角形单层细胞，由组织块向周围呈放射状生长。经PAS特殊染色70%以上的细胞呈阳性反应。

2.2DC的形态学观察及功能检测：结肠癌患者呈贴壁贴壁生长的PBMC经GM-GSF、IL–4和TNF-α联合诱导7d后，大部分细胞呈悬浮状生长，体积明显增大，形状不规则，并且有不停伸缩运动的毛刺状突起,具备了典型成熟DC的形态特征。流式细胞仪检测结果显示，mDC和RNA-mDC细胞表面CD83、CD86、MHCII类分子的表达明显增加，且持续高表达MHCI分子。MLR分析结果表明，诱导7d获得的mDC及RNA-mDC具有强大刺激自体/异体T细胞（CD3+>95%）增殖的能力,而未加TNF-α的imDC则不能有效刺激T细胞增殖。

2.3CTL对自体或异体原代培养结肠癌细胞的杀伤率：RNA-mDC诱导产生的CTL对自体结肠癌细胞杀伤率显著高于对异体原代结肠癌细胞组(P<0.05)。表明肿瘤RNA被mDC递呈后，能有效刺激产生对自体肿瘤细胞具高度特异杀伤活性的CTL。

2.4细胞因子检测：RNA-mDC组细胞培养上清中IL_12的浓度高于mDC组(P<0.05)，并显著高于imDC组(P<0.01)；RNA-mDC刺激产生的CTL组上清中INF-γ的浓度高于mDC组(P<0.05)，并显著高于imDC组(P<0.01)。

3讨论

现已证明对肿瘤细胞免疫耐受是肿瘤在体内长期生存与不断生长的关键因素。体内肿瘤细胞通过多种方式逃避免疫系统的识别；另外，肿瘤细胞分泌IL-10、IL-6、TGF-β等免疫抑制因子阻止DC成熟，未成熟DC即便俘获并提呈肿瘤抗原给T细胞，也不能激活T细胞［７］。

因此提高抗肿瘤免疫效应就必须制备有效的肿瘤抗原；获得具有强大抗原提呈能力的mDC和提高肿瘤抗原的表达水平。

用肿瘤全细胞抗原对DC进行修饰刺激机体产生抗肿瘤免疫效应，近年来已被广泛接受。与各种形式的全细胞抗原比较，肿瘤细胞总RNA具有明显优势。研究结果显示，在GM-CSF、IL-4、TNF_α作用下，经7d体外培养，大部分贴壁PBMC发育为mDC，高表达抗原提呈分子和共刺激分子，具有高效刺激自体T细胞增殖的能力。转染自体结肠癌细胞总RNA的mDC具有更高的IL-12分泌能力，激活T细胞产生的CTL上清液中IFN_γ水平显著提高。上调DC及肿瘤细胞抗原提呈分子及共刺激分子的表达［8］，可加强DC的抗原提呈功能，同时也可提高肿瘤细胞抗原表达及CTL对其识别杀伤的能力。但是，RNA转染DC治疗肿瘤的分子机制尚不明确。

我们经短期培养制备了三株生长稳定的原代结肠癌细胞，将其作为靶细胞用于细胞毒杀伤实验，结果显示经自体抗原致敏的CTL对自体肿瘤细胞的杀伤率显著高于另外两株异体肿瘤细胞。表明CTL识别肿瘤细胞表面抗原肽具有个体特异性，同种异体肿瘤细胞可能表达肿瘤相关抗原，但缺乏与特异性CTL相适应的HLA表型，因此不能被有效的识别和杀伤，提示临床抗肿瘤免疫治疗应采取个体化方案。

参考文献

［１］SteinmanRM,CohnZA.Identificationofanovelcelltypeinperipherallymphoidorgansofmice:morphology,quantitation,tissuedistribution［J］.JExpMed,1973,137(1):1142—1162.

［2］SteinmanRM.Thedendriticcellsystemanditsroleinimmunogenicity［J］.AnnuRevImmunol,1991,9:271-296.

［3］PonsaertsVFI,VanTendelooZN,BernemanP.CancerimmunotherapyusingRNA-loadeddendriticcells［J］.ClinExpImmunol,2003,134(3):378—384.

［4］TakehikoF,YutakaY.AutologoustumorkillingactivityasaprognosticfactorinprimaryresectednonsmallcellcarcinomaoftheLung［J］.Cancer,1997,79(3):474-481.

［5］ShirleyM,BartidoKZ.T-cellresponsestomultipleantigenspresentedbyRNA-transfectedAPCs:apossibleimmunomonitoringtool［J］.CancerImmunolImmunother,2004,53(2):100—109.

［6］TadashiM,WongiM,HyunSL.LymphocyteproliferationresponseduringEimeriatenellainfectionassessedbyanew,reliable,nonradioactivecolorimetricassay［J］.AvianDiseases,2002,46(1):10-16.

［7］RestifoNP.NotsoFAS:Re-evaluatingthemechanismsofimmuneprivilegeandtumorescape［J］.NatMed,2000,6(5):493-495.

［8］CarrelS,Schmidt-KesseA,GuiffrkL.Recombinantinterferon-gammacaninducetheexpressionofHLA-DRand-DConDR-negativemelanomacellsandenhancetheexpressionofHLA-ABCandtumor-associatedantigens［J］.EurJImmunol,1985,15(2):118-123.