冰片对耐药肿瘤化疗效果影响实验研究

冰片对耐药肿瘤化疗效果影响实验研究

占宏伟刘洪彪叶小娟王菁方圣伟

占宏伟刘洪彪叶小娟王菁方圣伟（浙江大学医学院附属第二医院核医学科浙江杭州310009）

【摘要】目的在体研究冰片对脑内、脑外恶性肿瘤化疗疗效的影响，以明确冰片是否有逆转恶性肿瘤耐药性的作用。方法取Wistar大鼠，制成皮下和脑内C6脑胶质瘤（C6）和耐药C6脑胶质瘤（C6R）肿瘤模型，分成对照组、MMC（丝裂霉素C）治疗组和冰片+MMC治疗组，观察各组肿瘤生长情况。结果与对照组比较，单用MMC治疗，大鼠C6皮下肿瘤明显缩小，耐药的C6R皮下肿瘤、脑内C6肿瘤和C6R肿瘤均未见明显缩小；加用冰片后，MMC治疗使C6皮下肿瘤、耐药的C6R皮下肿瘤、脑内C6肿瘤和脑内C6R肿瘤均有不同程度缩小。结论冰片可促进MMC透过BBB进入脑内，同时可逆转肿瘤细胞耐药性，从而起到增加脑内耐药肿瘤化疗疗效的作用。

【关键词】冰片耐药肿瘤化疗疗效

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）23-0045-02

化疗是目前治疗恶性肿瘤的常用方法，肿瘤细胞产生多药耐药性(MDR)是化疗失败常见的原因。对于脑内的恶性肿瘤，由于许多化疗药物不能通过血脑屏障，因此化疗效果更受影响。冰片本身极易通过血脑屏障进入脑内[1]，还可促进BBB的生理性开放，使顺铂、庆大霉素、川芎嗪等药物易于透过血脑屏障进入脑内[2-4]。同时，体外研究表明，冰片对细胞膜上P-糖蛋白(P-gp)的活性具有抑制作用[5-6]。因而，冰片有可能提高脑内耐药肿瘤化疗疗效。本研究建立大鼠耐药C6脑胶质瘤模型，探讨冰片对脑内耐药肿瘤化疗疗效的影响。

1材料与方法

1.1材料与仪器健康Wistar大鼠，清洁级，雄性，体质量约150-200g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。C6大鼠脑胶质瘤细胞由中国科学院上海细胞生物所提供。硫酸长春新碱（VCR）和丝裂霉素C（MMC）为浙江海正药业股份有限公司产品。冰片为湖南株洲松本林化有限公司产品，配成15％（m/v）的冰片石蜡油溶液。

1.2耐药脑胶质瘤C6细胞系（C6R）的建立根据SasajimaT等人[7]的方法，简单来说，取C6细胞（C6），在培养瓶中进行单层培养，并在培养液中加入小剂量长春新碱（终浓度为1ng/ml），传代培养超过25次后，即可得到耐VCR的C6细胞，经鉴定后备用。

1.3脑胶质瘤大鼠肿瘤模型的建立取C6细胞和耐药C6细胞，数量各为2×106/10ul，分别注射于同一只Wistar大鼠的左右大腿外侧皮下，制成皮下肿瘤模型。5天后，将已制成皮下肿瘤模型的大鼠固定在脑立体定向仪上固定，剪去头顶部毛发，常规消毒，在头顶双侧眼裂连线后大约1.5cm处纵向切开头皮，暴露前囟颅骨标志，根据Batker法确定尾状核靶点，于冠状缝后1mm，中线左或右旁开3mm，用牙科钻钻一直径1.0mm的小孔，微量注射器吸取C6细胞或C6R细胞，数量为1×106/10ul，沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6mm，再回退1mm，注射速度为1μl/min，共注射10min，注射完毕后留针5min，缓慢退针，再进行另一侧的操作。注射好后骨孔用骨蜡封闭，缝合切口后消毒皮肤，即制成脑肿瘤模型。这样，同一只大鼠体内包含了C6、C6R的皮下和脑内肿瘤。

1.4分组及处理：制成的肿瘤模型大鼠随机分为以下几组

1.4.1对照组：8只，从第11天开始每天灌服1次石蜡油溶液，10ml/kg，共5天，然后继续饲养5天。

1.4.2MMC治疗组：8只，从第11天开始灌服石蜡油溶液，10ml/kg.次，灌胃后半小时给予MMC1mg/kg，ip，每天一次，共5天，然后继续饲养5天。

1.4.3冰片+MMC治疗组：8只，从第11天开始灌服15%冰片石蜡油溶液，10ml/kg.次，灌胃后半小时给予丝裂霉素C（MMC）1mg/kg，ip，每天一次，共5天，然后继续饲养5天。

以上所有大鼠每3天测量一次皮下肿瘤的大小，第20天处死大鼠，剥离皮下肿瘤称重，取全脑，10%甲醛溶液固定后沿肿瘤中心作冠状切面，水平方向测量每个肿瘤最大横截面面积(包括坏死等病变组织)。

1.5统计学方法应用SPSS13.0软件（Chicago,IL,USA）进行统计学处理，比较各组间皮下肿瘤重量，脑内肿瘤最大横截面面积大小，数据以均数±标准差(x-±s)表示，均数比较采用t检验。

2结果

与对照组比较，MMC治疗组大鼠C6皮下肿瘤可见明显缩小（t=4.262，P<0.01），但耐药的C6R皮下肿瘤、脑内C6肿瘤和C6R肿瘤均未见明显缩小（P>0.05）。而在冰片+MMC治疗组，与MMC治疗组对比，除C6皮下肿瘤同样明显缩小外，耐药的C6R皮下肿瘤（t=2.282，P<0.05）、脑内C6肿瘤（t=3.282，P<0.01）和脑内C6R肿瘤（t=2.646，P<0.05）也均有不同程度缩小（图1、图2），说明冰片起到了促进药物透过BBB进入脑内的作用，同时也起到了逆转肿瘤细胞耐药性的作用。

3讨论

目前，在颅内恶性肿瘤的综合治疗中化疗仍是重要一环。而颅内肿瘤的化疗效果明显不如颅外肿瘤，其原因主要是因为血一脑屏障的存在和肿瘤细胞本身对抗肿瘤药物的耐药性。

冰片在中药方剂中常作为佐使药和引药，与药物归经有关。冰片具有促进BBB的生理性开放作用，使许多化疗药物易于透过血脑屏障进入脑内，同时，体外研究也表明冰片有抑制细胞膜上P-gp活性的作用。我们通过建立大鼠耐药C6胶质瘤脑内、脑外模型，合用冰片和化疗药物进行治疗，结果显示脑内、脑外的耐药肿瘤均有明显的缩小，说明冰片不但促进化疗药物进入脑内，同时对肿瘤的耐药性具有一定的逆转作用。

肿瘤MDR是多因素介导的，如P-gp、多药耐药相关蛋白(MRP1)、凋亡调控等，其中对P-gp介导的MDR的药物逆转的研究是是目前开展最为广泛和有极大实际使用价值的研究。目前许多抑制P-gp的药物已被证实，包括钙通道阻滞剂、激素、蛋白激酶C(PKC)抑制剂、免疫抑制剂、抗生素、表面活性剂等，但均存在毒副作用较大或效果不确切等不足[8]。中药是祖国医学用来防治疾病的有力武器，具有取材方便、价格低廉和毒副作用小等优点，已有研究显示多种中药单体和复方制剂具有逆转肿瘤多药耐药的作用[9,10]。

体外研究表明，冰片对MDCK细胞膜上P-gp的活性具有抑制作用，冰片与丹酚酸B联合应用可以显著抑制血脑屏障脑微血管内皮细胞mdr1mRNA的表达，进而可能降低P-gp的功能性表达[5,6]。因而，冰片有可能是通过抑制P-gp功能而起作用，不过，目前冰片对P-gp影响方面的研究开展得较少，且仅限于体外，体外研究实验的模型和体内实验还是有一定的差距，因为体内微环境复杂，有各种因素共同影响实验结果。我们的实验为在体研究，弥补了这一不足，初步证实了冰片有促进脑内耐药肿瘤化疗疗效的作用。

冰片对P-gp的影响，可能从转录和翻译水平抑制P-gp的表达，也可能通过与抗肿瘤药物竞争P-gp的药物或ATP结合位点、或通过对肿瘤细胞膜或Ca2+浓度的影响等而起作用[11]。本研究的结果仅仅是最基本的一步，具体作用机制有待更多的实验探索。

参考文献

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基金项目：浙江省中医药管理局基金（2009CA067）