无细胞蛋白表达体系在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达体系在生物制药工程中的应用

苏洪振

苏洪振

中山康方生物医药有限公司

摘要：随着技术的日益成熟，无细胞蛋白表达体系以其成本低、操作简单的特点，受到了业界的一致好评。尤其是在生物制药领域，能够有效的在体外合成蛋白质，较传统蛋白表达相比更加省时省力。基于此，笔者在文章中首先简要说明了无细胞蛋白表达的两种常见形式；其次，介绍了近几年在该项技术上所取得的重大突破；最后，提出了若干无细胞蛋白表达的应用措施，以供参考。

关键词：生物制药；无细胞蛋白；技术进展；应用措施

引言

以往的蛋白表达体系在制药过程中虽然也有着不俗的表现，但这种技术容易受到生理限制。比如在蛋白表达时需要耗费较长的时间来降解，同时还对下游产物的处理有着十分苛刻的要求。因此，就导致生物药的成本更加高昂，技术水平也长期得不到改良。而无细胞蛋白在应用中不存在水溶性和半衰期的缺陷，在制药生产中无疑更加便利。

1、无细胞蛋白表达体系的分类

（1）原核系统

所谓原核系统指的是借助于原核生物，来提取细胞蛋白产物。通常而言，原核生物都表现出较高的耐受性，所以在蛋白表达中相比与传统办法稳定性就得到了保障。在实际操作中，技术人员首先对目标蛋白的各项参数进行分析，从而制定出合理的添加剂方案。近年来业界大量使用大肠杆菌等原核生物参与制药，其不仅表达效果较传统技术更佳，而且也极大的降低了药物的成本损耗。不过值得注意的是，原核生物的内部结构较为简单，因此所能携带的信息量也比较有限。

（2）真核系统

除了原核系统外，真核系统在蛋白表达体系中的应用也十分广泛。顾名思义，这种技术则是利用真核生物参与表达，能够携带更丰富的信息量。而且与原核系统相比，真核系统也不会受到非特异性抑制，所以最终参与表达的效果也能远超预期。在实际操作中，技术人员可以将模版转化为线性结构，如此一来能显著提高蛋白质的稳定性。大量实践证明原核、真核系统在蛋白表达中的合成产出均十分可观，但两者又有着各自不同的特点和优势。因此，在应用中仍然需要结合目标蛋白质的性质，来合理的选择表达方案。

2、无细胞蛋白表达体系的新进展

（一）稳定性大幅提高

在蛋白生物制药中，抽提物的稳定性一直都是技术的关键指标。而传统的蛋白表达体系中，容易在反应过程中生成部分抑制物，给蛋白表达的进一步开展造成极大的阻碍。不仅如此，在无细胞表达体系研究初期阶段，由于没能解决内部代谢问题，也使得制药的成本较为高昂。而随着业界和学界不断攻坚克难，使抽提物的代谢问题得到了缓解。技术人员通过实验得出，在抽提物种不仅存在磷酸化反应，而且还具备能量网络。这就使无细胞表达也能得到充足的代谢支持，使生产能够有效进行。而且，针对抑制产物的问题也提出了一些行之有效的解决方法，使目标蛋白的稳定性得到了一定程度的提高。比如部分企业在生产中直接添加麦芽糖，这不仅能够提供大量的能量，而且还消耗了工艺中的无机磷。抑或是直接着眼于降解酶的清除，使氨基酸在反应中的效率能够得到保障。

（二）表达蛋白的折叠

由于在传统蛋白表达体系中相邻的地带容易互相影响，在各异的疏水环境下目标蛋白可能遭到一定的破坏。比如该区域的化学环境被改变，蛋白质的结构就受到了威胁，甚至可能参与到其它反应中而被消耗。因此，在折叠中就必须要考虑到隔离保护的目的。比如技术人员可以在工艺中添加铁硫簇，加速二硫键的转化。而无细胞表达则不存在此类顾虑，可以直接在相同地带进行合成，无疑使制备过程更加简单可行。技术人员可以向抽提物内加入少许酶抑制剂，同时借助于DsbC即可令二硫键形成。而在蛋白折叠环节，也可以通过多糖来促进结合。比如业界常用的纳米凝胶，能够显著降低链的释放，避免了折叠过程中的沉淀问题。这些关键技术得以整合后，使无细胞表达体系在目标蛋白的合成中成本更低，而合成的效率却也较以往更高。

3、无细胞蛋白表达体系的应用

（一）非天然氨基酸的开发

传统蛋白质大多为天然合成，虽然在医药领域也有着重要的作用，但始终难以适应不断发展的技术要求。比如天然蛋白质的结构趋于固定，因此其功能也表现出单一的特点，用作生物制药中仍有着明显的缺陷。近几年业界开始尝试对蛋白质进行改造修饰，从而使目标蛋白的生物学特性更符合生产的需求。部分企业在蛋白质表达工艺中加入了一些非天然的氨基酸，并且在序列中能够与原基团共价结合。经过临床验证，使用非天然氨基酸合成的蛋白质在使用过程中更加方便，而且也使药物的耐受性得到了明显的提升。尤其是当下大量药物需要应用到蛋白，这都需要无细胞表达技术来支撑。

（二）复合体的表达

复合体合成也是无细胞体系的重要内容，在疫苗等药物的生产中有着较好的疗效。这种药物是通过模拟病毒来刺激人体免疫应答，从而生成一定的抗原抗性。同时为了确保该模拟药物在人体内不进行传播，也必须确保其中不含有病毒遗传物质。无细胞表达技术恰好符合这一要求，能够直接生成病毒蛋白，而其内容呈现出空心状。比如有企业在类病毒颗粒的生产中，就广泛使用无细胞表达体系。技术人员首先控制好合成工艺中氧化反应，然后再通过二硫键来调节合成的进行。通过这种技术的处理，使疫苗测试过程更加安全可靠，同时也能及时产生抗性。

（三）靶标膜蛋白表达

哺乳动物的基因有很大一部分属于膜蛋白，因此均具有良好的药物靶细胞潜质。在无细胞表达体系中，也就应该充分认识到膜蛋白合成的重要性，扩大这项技术的应用范围。不过在实际应用中，由于膜蛋白本身的特点也存在以下几个技术难题。其一，在膜蛋白合成时若未能控制好量，则可能出现沉淀现象。这一现象具有一定的毒性，从而给患者的安全造成隐患。其二，膜蛋白的折叠也较为困难。在操作中需要处理好人工脂质，使其生成活动能够有序开展。其三，膜蛋白的人工脂质处理也是技术重难点之一，更加剧了技术落实难度。在具体应用中，技术人员应该利用去污剂等来构建一个良好的合成环境，促进蛋白生成。

（四）高通量蛋白表达

从生物制药近几年的发展趋势不难发现，高通量蛋白的药用效果更加突出，而且应用范围也呈现出逐渐扩大的现象。笔者认为，此后很长一段时间里高通量蛋白都是业界和学界研究的重要课题。而传统蛋白表达体系在合成中效率较低，给这项技术的普及推广带来了一定的难度。相比之下，无细胞蛋白表达则显得更有先天优点。比如在合成过程中，无细胞表达不需要进行基因克隆，使合成的流程更加简单。此外，高通量蛋白的合成还可以借助于芯片的控制，在合成过程中可控性更高。最后值得一提的是，在高通量蛋白中膜结构并不需要参与反应。在无细胞表达体系中，一旦发现异常则技术人员可以及时矫正，通过外界的干扰来规范合成的进行。

结语

综上所述，随着生物制药技术的不断成熟，蛋白表达体系的应用越来越广泛。尤其是无细胞体系在操作中更简单、成本更低，因此必将成为业界应用的主流技术。针对近几年无细胞表达所取得的技术突破，笔者认为在非天然氨基酸、复合体、膜蛋白以及高通量蛋白的表达中具有一定的优势。希望通过本文的研究，能够促进无细胞表达体系的发展，为我国医疗事业尽一份力量。

参考文献

[1]王雪，权春善，王建华，范圣第.不同细胞破碎方法对无细胞蛋白表达系统细胞抽提物活性的影响[J].中国生物工程杂志，2011，31（01）：46-50.

[2]马英伟，温红玲，王志玉，刘春晓.无细胞蛋白合成系统的发展及应用[J].中国卫生检验杂志，2016，26（01）：150-152.

[3]贾晓歌，邓子新，刘天罡.无细胞蛋白表达体系研究进展及在生物制药领域中的应用[J].微生物学报，2016，56（03）：530-542.