实时荧光PCR技术在沙门菌与志贺菌筛查中的应用

实时荧光PCR技术在沙门菌与志贺菌筛查中的应用

刘永强1徐海燕2

1.大庆市疾病预防控制中心微生物科黑龙江大庆163001；

2.大庆市疾病预防控制中心信息科黑龙江大庆163001

摘要：目的分析实时荧光PCR技术在沙门菌与志贺菌筛查中的临床应用价值。方法收集2016年10月～2017年10月于医院门诊就诊患者的520例肛拭子为研究对象，分别采用实时荧光PCR法和传统培养法进行对比检测，分析实时荧光PCR技术的灵敏度、特异度并比较两种方法的检测时间。结果实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的时间均显著少于传统培养法[（2.24±0.53vs4.52±0.71）d、（2.31±0.44vs4.61±0.65）d]；实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的灵敏度均为100%，特异度分别为98.63%和97.24%。结论实时荧光PCR技术检测沙门菌、志贺菌的时间短，灵敏度、特异度高。

关键词：实时荧光PCR技术；沙门菌；志贺菌

Applicationofreal-timefluorescencePCRinscreeningofSalmonellaandShigella

LiuYongqiang1，XuHaiyan2

（1.DepartmentofMicrobiology，DiseaseControlandPreventioncenterofDaqingCity，HeilongjiangDaqing，163001；

2.DepartmentofInformation，DiseaseControlandPreventioncenterofDaqingCity，HeilongjiangDaqing，163001）

AbstractObjectiveToanalyzevalueofreal-timefluorescencePCRinscreeningofSalmonellaandShigella.Methods520analswabsinpatientsinouroutpatientsofhospitalfromOctober2016toOctober2017wereselectedasresearchobject，everyspecimenscreenedbyreal-timePCRmethodandtraditionalculturemethod.Thesensitivityandspecificityofreal-timePCRmethodwereanalyzedandmeasuringtimeoftwomethodswascompared.ResultsThetimeofrealtimePCRmethodfordetectionofSalmonellaandShigellawassignificantlylessthantraditionalculturemethod[（2.24±0.53vs4.52±0.71）d、（2.31±0.44vs4.61±0.65）d]（P＜0.05）.ThesensitivityofthedetectionofSalmonellaandShigellabyrealtimePCRmethodwas100%andthespecificitywas98.63%and97.24%.ConclusionThetimeofdetectionofSalmonellaandShigellabyfluorescencePCRtechniqueisshort，andthesensitivityandspecificityoffluorescencePCRtechniquearehigh.

Keywords：realtimePCRmethod；Salmonella；Shigella

沙门菌、志贺菌是引起肠道感染和细菌性食物中毒的主要致病微生物[1]。临床上的常规检测方法为传统培养法，由于检测时间长、接种工作量大，不能及时、有效筛查大批量的健康人群，且处置突发公共卫生的时间有限[2]。因此，寻找一种能快速、准确筛查出沙门菌、志贺菌的方法对防治传染病有重要意义。实时荧光PCR技术作为分子水平上的诊断方法，能直接检测出病原体的存在情况，客观反映其在人体内的感染及活动情况，具有较高的灵敏度、特异性[3]。本研究通过与传统培养法检测效果进行对比，探析实时荧光PCR技术在筛查沙门菌、志贺菌中的应用价值。

1研究对象与方法

1.1对象

收集2016年10月～2017年10月于医院门诊就诊520例患者的肛拭子为研究对象，每份肛拭子均分别用传统培养法和实时荧光PCR技术进行检测。

1.2仪器与试剂

qTOWER3Gtouch荧光定量PCR仪（德国），11230BBC86生物安全柜（济南鑫贝西），Thermo全自动细菌鉴定仪（英国），TGL21M台式离心机（长沙湘智），恒温培养箱（上海姚氏），木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养皿（上海博华，批号：20150617），克氏双糖铁琼脂培养皿（青岛海博，批号：20160226），动力-吲哚-尿素酶生化管（上海江莱，批号：20150804），沙门菌显色平板（南京森贝，批号：20160417），兰阴性细菌鉴定卡（上海拓赫，批号：241339140），沙门菌多价诊断血清（山东青岛，批号：20160422），志贺菌多价诊断血清（山东青岛，批号：20160805），沙门菌及志贺菌核酸联合检测试剂盒（山东青岛，批号：P20150701）。标准菌株：由中国医学细菌保藏管理中心提供CMCC50115鼠伤寒沙门菌、CMCC51572福氏志贺菌。

1.3方法

1.3.1采样均取截石位，将肛拭子插入肛门齿状线内3cm处，顺时针旋转3周后，取出肛拭子放入SS增菌液并混匀，后放置在恒温培养箱增菌，温度为35℃，时间约18h～24h。

1.3.2传统培养法采用3区划线法，将增菌后的菌种接种到木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养皿上，放入35℃恒温培养箱中增菌18h～24h。取出培养皿，挑出初步怀疑为沙门菌和志贺菌的菌落，并将其接种到克氏双糖铁管、动力-吲哚-尿素酶生化管进行初步鉴定及培养，排出部分非沙门菌、志贺菌后，将剩余纯化培养后的菌落进行G+染色、显色培养皿培养、菌种鉴定和血清学分型。

1.3.3实时荧光PCR法各取2滴SS增菌液增菌后的菌液于1.5ml离心管中，并以13000r/min转速离心2min，去掉上清后将沉淀洗涤一次，加入50uL核酸抽提液充分摇匀，放置于99℃煮沸5min，再以13000r/min转速离心10min，取4uL上清液做PCR反应。采用qTOWER3Gtouch荧光定量PCR仪进行扩增，时间、温度依次设置为37℃，2min→94℃，2min→93℃，15s→60℃，60s，循环40次后进行鉴定。

1.4评价标准

阳性标本检测后Ct<38，重复测定Ct仍为38~40，则为阴性。检测混合标本为阳性，则进行扩增，将扩增得到的阳性标本同培养法进行对比，若是同一标本则停止培养，如培养法阴性、荧光PCR法阳性对原始标本进行再次培养。检测时间：从标本接收开始，到发出报告为止。

1.5统计学方法

采用SPSS22.0进行数据分析，计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验，P<0.05表示有统计学意义。

2结果

2.1两种方法检测时间比较

实时PCR法检测沙门菌的时间（2.24±0.53）d和志贺菌的时间（2.31±0.44）d均显著低于传统培养法（4.52±0.71）d，（4.61±0.65）d。

2.2实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的结果分析

实时PCR法检测沙门菌的灵敏度为100%，特异度为98.63%，检测志贺菌的灵敏度为100%，特异度为97.24%，见表1、2。

表1实时PCR法检测沙门菌的结果分析

注：灵敏度=[12/（12+0）]×100%=100%；特异度=[494/（14+494）]×100%=97.24%

3讨论

沙门菌、志贺菌是引起食物中毒的主要致病因素，其分布广泛、血清型多变。据统计，沙门菌约有2000个血清型，其中D群的肠炎沙门菌在引起食物中毒因素中的占比较大；而志贺菌的流行菌群变异较快，约20～30年发生一次菌群的更换[4-5]。目前，传统培养法仍是主要的筛查方式，但其对操作人员、操作环境要求较高，受主观影响较大。而实时荧光PCR法将增菌液在PCR仪上进行自动扩增，避免了后期的细菌分离和生化鉴定等工作，在一定程度上减少了筛查时间及后期杂菌污染的可能性[6]。

本研究结果显示，实时PCR法筛查沙门菌、志贺菌的平均时间显著低于传统培养法，提示实时PCR法在完成标本的快速筛查方面具有一定的优势。此外，实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的灵敏度均为100%，特异度分别为98.63%和97.24%，提示实时PCR法在筛查沙门菌、志贺菌方面具有较高的准确性、特异性，与既往报道一致[7]。王琳等[8]发现，大批量人群筛查结果中，实时PCR法的总花费低于传统培养法，提示实时PCR法在大批量检测时可有效降低成本。

综上，实时PCR法筛查沙门菌、志贺菌的时间短、准确率高、特异性强，尤其适用在处理突发卫生公共事件中对大批量标本的筛查。

参考文献：

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[6]提会芹，李尊艳，刘桂茹.多重聚合酶链反应技术检测食源性致病菌的实验研究[J].山西医药杂志，2014，43（17）：2037-2038.

[7]陈棋炯，丁水军，孙永祥，等.实时荧光PCR技术在预防性健康检查沙门菌与志贺菌检测中的应用[J].中国卫生检验杂志，2015，25（12）：1937-1940.

[8]王琳，江鹏飞，李贻汉，等.荧光PCR在基层从业人员带菌检测中应用的可行性评价[J].中国卫生检验杂志，2013，23（3）：664-666.