TRPC3在61例重症肌无力伴胸腺增生患者肌肉的表达及意义

TRPC3在61例重症肌无力伴胸腺增生患者肌肉的表达及意义

姚世源程超

中山大学附属第一医院胸外科广东广州510080

关键词：电视胸腔镜胸腺扩大切除术；重症肌无力；胸腺摘除；TRCP3

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0366-02

重症肌无力（myastheniagravis,MG）被认为是一种自身抗体介导的自身免疫性疾病，主要由于神经肌肉接头（neuromuscularjunction，NMJ）功能受损引起的一系列疲乏和肌肉无力症状1。抗原抗体反应激活补体系统形成的膜攻击复合物（membraneattackcomplex，MAC）对NMJ突触后膜的损害导致AChR受体和群集（clusters）数量的减少是MG的主要病理生理特征2。目前认为在MG疾病早期多表现为眼肌受累称为眼肌型MG,随着疾病进展而全身多处肌肉受累称为全身型MG。免疫功能异常为其发病机制之一，且对于全身型的MG患者可以从切除胸腺这一免疫器官中获益3。因此目前研究仍集中在患者的免疫和异常血清抗体谱，较少涉及受累肌肉本身的病变。然而临床工作中仍经常碰到肌无力危象发作的患者，其四肢肌力正常，但伴随呼吸肌麻痹。因此循环免疫性性抗体来说难以解释受累肌肉选择性。对于肌肉组织来说，兴奋偶联收缩异常仍是肌无力的原因。瞬时电位受体通道3型（transientreceptorpotentialcanonicaltype-3，TRPC3)与RyR1相互作用，共同控制兴奋偶联收缩时肌质网内（SR）的Ca2+释放。有报道称MG合并胸腺瘤患者中血清中存在TRPC3的抗体，且其阳性情况主要和患者的MGFA分级相关。4本研究通过分析61例行胸腔镜手术的MG伴随胸腺增生的患者的膈肌中TRPC3的表达情况，结合患者的临床资料分析其表达情况及可能意义。

1、材料和方法

1.1、病人资料

本次试验选取了2011.02.28-2014.12.01期间于本院就诊的重症肌无力患者61例手术治疗资料进行研究分析，所选取患者均在本院接受了电视胸腔镜胸腺扩大切除术。患者中共有男性22例，女性39例；年龄11-69岁；患者患病历程在6个月到7年之间，平均病程在19个月。手术前，所有患者均进行了神经内科诊断及治疗。53例患者口服胆碱酯酶抑制剂（溴吡斯的明）；25例口服类固醇制剂（甲泼尼龙），其中2例患者在术前进行了2次血浆置换，2例行丙种球蛋白冲击治疗。术前对患者行Osserman分型：I型为单纯眼肌型，IIa为轻度全身型，IIb为中度全身型，III为急性爆发型，IV为肌无力危象。本课题研究无V型患者。

1.2、手术方法

麻醉前行双腔气管插管，常规以右侧胸腔入路，患者左侧45。斜卧，取右腋中线第7肋间隙切口作为镜孔，腋前线第3、5肋间各作2cm大小切口为操作孔。入右侧胸腔后于胸骨后-上腔静脉-右心房交界处剪开纵隔胸膜，自下而上分离胸腺右叶外缘，自颈根部游离右叶上级，显露左无名静脉；剪开胸骨后纵隔胸膜，将胸腺整片游离达胸腺右叶下极，清理周围脂肪组织。解剖胸腺静脉，超声刀离断。仔细游离左颈根部，牵出左侧胸腺上级，自上而下沿左肺门游离直至将整个胸腺切除。清理主一肺动脉间隙组脂肪一异位胸腺及向下清除心包周围脂肪。注意清除颈根部周围残留脂肪组织。手术完成后，于右膈胸腔面，超声刀烙取5mm*5mm的膈肌组织。迅速保存至液氮，留待后续检测。

1.3、western检测TRPC3

（1）蛋白提取

将约0.1ug组织加入PIPA细胞裂解液100μl，4℃冰上放置30min，匀浆器匀浆，将悬液收集至2ml离心管中，4℃，12000×g，10min，取上清液放入-80℃冰箱保存待用。

（2）BCA法蛋白定量

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准蛋白（0.5mg/ml）按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，加2μl体积样品到96孔板样品孔中，加标准品稀释液到20μl，标准蛋白孔和样品蛋白孔加入200μl的BCA工作液，37℃放置30min，用酶标仪波长560nm测定吸光度值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

（3）Westernblot

制胶：用洁净玻板配置好12％PAGE分离胶，将分离胶约4ml注入准备好的玻璃板中间隙。轻轻在顶层加异丙醇作为覆盖物。待凝胶完全聚合后，倒掉覆盖层，用吸水纸吸干凝胶顶端残留的异丙醇。配制浓缩胶2ml，并注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡。等分离胶凝聚后，拔去梳子。

电泳：将每组蛋白按照上样总量20μg计算出上样体积，加入10×蛋白上样缓冲液，沸水煮5min后，3000rpm离心3min，然后上样，并加入5μl蛋白maker作分子量指示。先恒压80v，30min；然后100v，90min。电转：电泳完毕后，按“夹心三明治”方式（分别放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵）将胶与PVDF膜（使用前在甲醇中浸泡5sec左右）夹在一起，冰浴中电转，恒压90v，90min。

封闭：用5％脱脂奶粉溶液将电转后的PVDF膜4℃过夜孵育。

孵育抗体:对应目的蛋白加入一抗anti-TRPC3（sigmaT5067，一抗滴度为1:1000），4℃过夜，常温摇床30min。内参β-actin抗体（sigmaA8481，1:1000）用来判断各组间的上样量是否一致。一抗孵育完毕后，室温下TBST洗膜3次，每次10min，加入荧光二抗避光室温孵育90min。荧光二抗滴度均为1:5000。荧光二抗孵育结束用TBST洗膜3次，每次10min。

曝光：使用双色红外激光成像系统按坐标放好膜，蛋白面朝下，设置好软件参数，扫描完成直接获得图片

1.4、Real-timePCRTRPC3mRNA的表达情况

方法:（1）RNA提取：称取80-100mg组织样本，加入1mlTrizol用组织研磨器进行匀浆裂解；65℃水浴30min后加入等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），震荡15s混匀后以12000g、4℃下离心10min，取上层液体加入等体积异丙醇，在常温下放置10min后12000g、4℃下离心10min，弃上清，加入1mlTirzol重悬，加入200ul氯仿剧烈震荡15s后室温静置5min，10000g、4℃下离心3min，将水相层转移至新RNasefreeEP管；加入0.5倍体积的异丙醇，涡旋混匀;加入1ml75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清,室温自然干燥，加入适量DEPC水溶解，并测定mRNA浓度及纯度。

（2）PCR检测：根据TAKARA逆转录试剂盒说明书配成总体系20ul的反应溶液；42℃保温60min；72℃保温15mn；-20℃保存备用。PCR的荧光定量检测用总体系为20ul，反应条件为95℃保温33s，60℃保温34s，共45个循环。溶解曲线分析为温度60-95℃，每分钟读取1次。引物序列：TRPC3F(5-CGTTCCAAACTCTGGCTATCC-3′),TRPC3R(5-AAGGCTGGAGATATCCTGCTT-3′)

β-actinF（5-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’），β-actinR（AGCACTGTGTTGGCGTACAG）

1、3统计分析

2、结果

2.1手术及围手术期情况

入组患者的平均手术时间为3.6（2.7）h小时，最长手术用时为10h。最短手术用时为56min；手术平均出血量为85（20）ml，最大出血量超过了450ml（损伤胸廓内动脉）。围术期死亡1例。术后病理证实胸腺增生59、合并异位胸腺的为12例，2例CT报告为胸腺增生术后病理证实为微小胸腺瘤。患者的平均恢复时间为20d左右。

2.2TRPC3蛋白的表达情况

Westernblot检测连续的5个活检标本中的TRPC3的蛋白表达水平，选取胸腺瘤但无MG的患者的膈肌标本中的TRPC3表达作为参照。发现case1-case4的表达均明显下降，而Case5的表达无明显下降。

2.3TRPC3的mRNA表达情况

我们通过real-timePCR的方法检测61例活检标本中的TRPC3的mRNA的表达情况。仍选取胸腺瘤不伴随MG的患者的膈肌标本作为对照。

2.4TRPC3的mRNA表达情况与患者临床特征及预后的相关性分析进一步，我们依据患者TRPC3的mRNA表达情况，参照control组的表达情况分为2组，即表达降低组（n=43）和表达不变或升高组（n=18），结合患者的临床特征及术后预后进行分析。疾病预后评估运用MGFApostinterventionstatus进行评估：improved：按QMG（参见表2）评分表评分后与治疗前相比显示症状较前明显好转；unchanged:按QMG评分表评分后于治疗前显示症状无变化；worse：按QMG评分表评分后与治疗前相比显示症状较前恶化。

讨论

目前观点认为重症肌无力仍是由于免疫异常而导致的神经肌肉接头障碍的疾病。其主要表现在患者血清的可以检测到的各种自身免疫抗体，如已经应用于临床诊断的Anti-AchR。主流观点仍认为AchR的功能异常直接导致了肌无力的发生。但临床上，40-70%患者的Anti-AchR是阳性的5。虽不排除有目前抗体的检测手段仍然具有一定的局限性，但是实际上作为一线治疗的乙酰胆碱酯酶抑制剂也很少能诱导MG完全长期的缓解，也不能阻止疾病进展，对全身型患者疗效欠佳6。

切除胸腺这一免疫器官对一部分MG患者确实有疗效。然而手术后的过度免疫激活，如B细胞活化因子、CD19、CD21、血清IgG含量，也认为是术后肌无力危象的发作的可能原因之一7。胸腔镜手术所带来的创伤较传统开胸明显减少。研究表明胸腔镜术后的血清IgG、补体C3含量和CD4+CD8+均较正中开胸组明显减少8,9。胸腔镜手术对减少术后的ICU停留时间和早期康复均有获益10。本研究纳入了61例患者均为内科规范化治疗后疗效不佳，由神经内科转至我科实施了胸腔镜手术。其中顺利行胸腔镜下手术为59例，中转开胸2例；围手术期因危象发作5例；随访期内（12-52个月），病症完全得到缓解的患者共有12例；病症部分改善的患者共有32例；治疗后完全无改善或继续恶化的患者共有17例。虽然大部分患者预后有改善，但仍有一部分的患者在胸腺切除联合+激素+胆碱酯酶抑制剂的治疗过程中病情仍进一步进展。目前基本上所有的研究都集中在患者的免疫细胞、血清学检查。较少研究涉及了效应器的改变。

本研究发现绝大多数的MG患者的膈肌中TRPC3的表达是下降的，并且其表达下降与患者的疾病严重程度是相关的。这个结果提示其在MG的发病过程中具有潜在诊疗意义。

之所以将TRCP3作为MG研究的靶点是因为其在调节细胞内Ca2+内流具有重要作用。在兴奋偶联收缩的过程中，TRCP3通过三联蛋白复合体（TRPC作为桥接链接JP-2和MG29）激活钙网蛋白、钙调蛋白、Ryr1，最终导致内质网的Ca2+通道开放，引起大量的Ca2+内流至细胞浆11,12。而这个通道开放过程并不受乙酰胆碱导致的细胞质膜产生的去极化和内质网本身的Ca2+含量的影响13。这种独立性与我们研究可能也是本演技中TRPC3的表达与内科治疗时使用的溴吡斯的明无关的原因之一。不仅如此，TRPC3作为跨膜蛋白，第5个和第6个跨膜域是暴露于细胞质膜外的，容易接受各种自身抗体攻击，进而被内吞降解14。并且国外已经有研究证实，约50%的合并胸腺瘤的MG患者中存在着针对TRPC3的抗体4。研究表明，TRPC3基因敲除的骨骼肌肌管中,直接激活RyR1导致的肌浆网释放的Ca2+显著减少，其偶联收缩的能力显著下降13。

通过临床相关性的分析，我们发现TRPC3的表达和患者的疾病严重程度是相关的。这可能是因为我们取的是膈肌组织，而对于临床症状严重的患者往往累及膈肌。不仅如此，TRPC3的表达也与患者的病程相关。这也可能是随着疾病的进展，抗体对于TRPC3的慢性损伤的一个重要原因，其损伤的可逆性仍需进一步研究。也这也提示我们在治疗MG过程中，除了对于免疫系统、神经肌肉的干预，也应该重视效应器的保护。

参考文献：

1.GomezAM,VanDenBroeckJ,VrolixK,etal:Antibodyeffectormechanismsinmyastheniagravis-pathogenesisattheneuromuscularjunction.Autoimmunity43:353-70,2010

2.Conti-FineBM,MilaniM,KaminskiHJ:Myastheniagravis:past,present,andfuture.JClinInvest116:2843-54,2006

3.GilhusNE:Autoimmunemyastheniagravis.ExpertRevNeurother9:351-8,2009

4.TakamoriM:AutoantibodiesagainstTRPC3andryanodinereceptorinmyastheniagravis.JNeuroimmunol200:142-4,2008

5.VincentA,Newsom-DavisJ:Acetylcholinereceptorantibodyasadiagnostictestformyastheniagravis:resultsin153validatedcasesand2967diagnosticassays.JNeurolNeurosurgPsychiatry48:1246-52,1985

6.MeriggioliMN,SandersDB:Autoimmunemyastheniagravis:emergingclinicalandbiologicalheterogeneity.LancetNeurol8:475-90,2009

7.ZahidI,SharifS,RoutledgeT,etal:Video-assistedthoracoscopicsurgeryortranssternalthymectomyinthetreatmentofmyastheniagravis?InteractCardiovascThoracSurg12:40-6,2011

8.ChenZ,ZuoJ,ZouJ,etal:Cellularimmunityfollowingvideo-assistedthoracoscopicandopenresectionfornon-thymomatousmyastheniagravis.EurJCardiothoracSurg45:646-51,2014

9.vonSegesserLK:EACTSdayinthenewEACTSHouse.EurJCardiothoracSurg43:215-8,2013

10.ChenZ,LuoH,PengY,etal:Comparativeclinicalfeaturesandimmuneresponsesafterextendedthymectomyformyastheniagravisinpatientswithatrophicversushyperplasticthymus.AnnThoracSurg91:212-8,2011

11.MoriY,TakadaN,OkadaT,etal:DifferentialdistributionofTRPCa2+channelisoformsinmousebrain.Neuroreport9:507-15,1998

12.TrebakM,BirdGS,McKayRR,etal:ComparisonofhumanTRPC3channelsinreceptor-activatedandstore-operatedmodes.Differentialsensitivitytochannelblockerssuggestsfundamentaldifferencesinchannelcomposition.JBiolChem277:21617-23,2002

13.LeeEH,CherednichenkoG,PessahIN,etal:FunctionalcouplingbetweenTRPC3andRyR1regulatestheexpressionsofkeytriadicproteins.JBiolChem281:10042-8,2006

14.WooJS,KimdoH,AllenPD,etal:TRPC3-interactingtriadicproteinsinskeletalmuscle.BiochemJ411:399-405,2008