MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用分析

MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用分析

刘林

黑龙江省鹤岗矿业集团公司总医院 154100

摘要: 目的：以 MALDI- TOF MS 为代表的蛋白质谱技术在微生物检验和科研中的应用分析。方法：文献检索及实际应用分析。结果：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI- TOF MS)是一种软电离质谱，适用于分析蛋白质等生物大分子物质，可用来绘制微生物的蛋白质图谱，最终可达到鉴定目的。基于MALDI-TOF MS的蛋白质谱技术具有快速、准确、敏感性高、高通量等特点，目前已应用于细菌和真菌的鉴定，结论：MALDI-TOF MS在微生物分型、耐药性分析等领域的应用初有成效，具有很大的应用发展空间。

关键词:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱; 临床微生物; 检验

病原微生物引起的感染性疾病严重威胁着人类健康，近年来随着抗菌药物滥用导致多种细菌耐药以及部分新型细菌的出现使形势更加严峻。传统的微生物鉴定方法主要是基于表型的检测，包括革兰染色、微生物培养和生化试验等，因时间较长、鉴定范围窄，影响了病原微生物鉴定的速度和准确性，在一定程度上阻碍了感染性疾病的控制。因此，临床上急需快速而准确的病原微生物鉴定方法以改善感染性疾病患者疗效。近年来质谱技术发展迅猛， 其中基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 ( matrix- assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作为蛋白质组学研究的支柱技术，在推动微生物蛋白组学发展的同时，也为基于蛋白质指纹图谱的微生物鉴定奠定了基础。本文就以 MALDI- TOF MS 为代表的蛋白质谱技术在微生物检验和科研中的应用作一综述。

1. MALDI- TOF MS 的原理

MADLI- TOF MS在微生物鉴定中的应用MADLI- TOF MS 是一种软电离技术，特别适用于分析蛋白质、多肽等生物大分子物质。它可以直接分析完整的蛋白质分子而不需要进一步粉碎，正是这一特点使其在分析完整微生物的蛋白质谱方面具有很大的优势^［1］。由于所得到的蛋白质图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定且进化保守的核糖体蛋白，因此，其鉴定结果稳定、可靠。用于微生物鉴定的样本既可以是分离培养的纯菌落，也可以是原始的临床样本^［2］。样本可以浓缩、纯化或是进行一些预处理以提纯蛋白，也可以不经任何处理直接用于检测^［3］。常规的临床微生物检测往往需要对大量不同的样本进行鉴定，这对MADLI-TOFMS的准确度和工作效率提出了挑战，目前已有许多研究对MADLI- TOF MS的临床应用价值进行了评估。

2. MADLI- TOF MS 对细菌、真菌的坚定

2.1 MADLI- TOF MS 对细菌的鉴定

MADLI- TOFMS在鉴定菌种的准确性上优于常规生化系统，MADLI- TOF MS 还为一些特殊的、难鉴定的、甚至是新型的重组细菌提供了一条新的检测思路。有研究者对MADLI- TOF MS在重组细菌的鉴定中进行了大胆尝试，提出MADLI- TOFMS不仅可以作为鉴定重组细菌的一种快速、准确、高通量的方法，还为突变菌株甚至生物恐怖细菌的鉴定提供了新的可能。

2.2 MADLI- TOFMS对真菌的鉴定

临床上由机会致病菌引起的侵袭性真菌感染逐渐增多，尤其是在免疫力低下的患者中，这是引起高发病率和病死率的重要原因。由于传统的生化方法不仅耗时而且需要相当的专业知识， 因此临床上迫切需要快速、可靠的方法来鉴定真菌和辅助抗真菌药物的治疗。经重复测试后，菌种水平上的准确率达到 97. 3%。在此基础上，结合Vitek MS system 和核糖体DNA测序，99.7% 的菌株得以准确鉴定，这为真菌感染监控的战略计划提供了切实可行的方法。

3. MADLI-TOF MS对临床样本的直接鉴定

MADLI-TOF MS在微生物鉴定中的优势除了其本身具有的快速、准确等特点外，还体现在可检测样本的多样性，除了临床分离得到的菌株，还可以直接用于原始样本的检测，其中以阳性血培养和尿液样本为主要代表。快速的病原菌检测对于血流感染的诊断和治疗有着极其重要的临床价值。血培养和鉴定是菌血症病原学诊断的金标准，而目前微生物实验室血培养和鉴定需要较长时间孵育，报告结果时间长，远不能满足临床对血流感染快速诊断的需要，MADLI-TOF MS有望解决这一问题。结果表明MADLI-TOFMS可以在短时间内高度准确地鉴定感染性尿液样本。

4. MADLI- TOF MS在科研中的应用

MADLI- TOF MS不仅在临床微生物鉴定中发挥着重要的作用，而且在微生物科研领域也有很大的应用前景。

4.1进行细菌耐药性分析

MADLI- TOF MS可以用来快速检测抗菌药物的耐药性。近年来甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的鉴别诊断对于临床治疗是一个很大的挑战。

4.2进行分型和毒力研究

细菌种类繁多，且同种细菌常常有多种血清型，不同型别的细菌其生理生化特性可能存在明显差异，致病性等方面也可能完全不同。因此，对同一种细菌进行快速分型是临床微生物研究的一项重要课题。由于质谱图具有菌株特异性,MADLI-TOF MS可用于细菌的分型，用该方法可快速检测PVL阳性的金黄色葡萄球菌，检测的敏感性可达100.0%，特异性达 90.6%。

4.3分析潜在的生物标志物

除了在微生物耐药性分析、分型以及毒力等方面的应用外，MADLI-TOF MS还可用于分析细菌或疾病中存在的生物标志物。

5. 小结和展望

以MADLI-TOFMS为代表的蛋白质谱技术具有快速、准确、灵敏、高通量等特点，加上其自动化和低消耗的优势而逐渐在临床微生物实验室被推广，并且有望在不久的将来取代传统的微生物鉴定方法。但是，现阶段MADLI- TOFMS在微生物鉴定中还存在一定的局限性，如微生物蛋白指纹图谱数据库不够完善，一些罕见菌种或新型细菌的图谱尚未被现有数据库收录，从而导致鉴定困难;含有混合菌种的血培养样本难以准确鉴别;同一菌属中相近的菌种容易错误鉴定;直接鉴定时，血培养和尿液样本中菌量对鉴定的影响;以及各临床实验室间由于培养习惯(培养基、培养时间、培养温度等)的差异对实验重复性的影响，这些问题都亟待解决。或许我们可以通过完善数据库、规范微生物的前处理、建立标准的检测流程提高准确性，还可以与部分常规方法相结合，最大程度上发挥蛋白质谱技术的作用。与此同时，MADLI- TOF MS已在微生物相关研究中崭露头角，它在今后的科研应用中还有很大的提升空间，有望在微生物耐药机制研究、细菌毒力因子研究、亚型分型等方面发挥更大的效用^[4]。随着蛋白质谱技术的不断发展，相信在不久的将来，它一定会成为微生物鉴定和科研领域的一大支柱。

参考文献

[1] 张丽,徐春英. MALDI- TOF MS在临床微生物实验室的应用研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2013,13(3):226-231.

[2] 戴颖欣,李敏.MALDI-TOFMS在临床微生物检验中的应用[J].检验医学,2015, 30 (2): 102-107.

[3] 曹艳,黄一灵,徐艳玲,等. MALDI-TOFMS技术在临床微生物检验领域的应用进展分析[J].临床与病理杂志,2015,35(1):123-127.

[4] 杨峰,陈飞,赵虎. MALDI-TOFMS在细菌耐药性分析中的临床应用[J].检验医学,2017,32(1):57-63.