儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病检测及其进展

儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病检测及其进展

龙雪，杨光能

昆明市儿童医院检验科 云南 昆明 650000

摘要：主要综述了急性淋巴细胞白血病(ALL）患儿检测体内微小残留病（MRD）的临床意义、现阶段主要使用的检测手段（PCR、FCM、NGS），寄希望于为提高ALL患儿MRD检出率及临床处理提供一定参考。

关键词：急性淋巴细胞白血病；体内微小残留病；PCR；FCM；NGS

急性淋巴细胞白血病(ALL）是发生于单个B或T淋巴细胞前体细胞的恶性肿瘤，主要包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)。其致病成因现阶段不具统一定论，较认可的理念是与离子辐射、先天易感性、化学物质、污染、病毒感染等因素具正相关连带性。MRD是ALL患者经诱导缓解治疗后(或骨髓移植后) ，于患儿机体内残留的具有形态学而难以常规检测到微量白血病细胞的病变状态。检测ALL患儿MRD对延长生存时间具有重要的现实意义，本文对此展开相关论述。

1 ALL患者检测MRD的临床意义

MRD临床检测意义及其应用于危险度分层治疗、制定治疗方案具有正相关连带性。因而，使用不同治疗方案的临床人员，多倾向于使用各具差异的MRD检测时间点、1或2种检测方法以及不同MRD阈值予以危险程度分级。例如St．Jude的XVI号方案，其将治疗第15d与第42d的骨髓中MRD水平检测予以危险的分级。第15d，若患儿MRD≥1%，主张开展经强化的诱导性缓解治疗；患儿MRD≥5%，则给予双重强化性治疗。而患儿MRD ≤0.01%，则给予次级强度的诱导治疗与低剂量蒽环霉素。标准危险度的ALL患儿若于第42d，MRD≥0.01%，则归类于高危；第42d MRD≥1%，将于首次至缓解时实施造血干细胞移植。同时仅仅检测并监护第42d MRD阳性且经缓解后的B-ALL患儿进，但所有T-ALL患儿均需使用外周血检测经缓解的MRD，若MRD持续呈阳性或转变为阳性，需再行造血干细胞移植。

2 现阶段检测ALL患儿MRD所应用方法

2.1 实时荧光定量检测（PCR）

PCR检测ALL患儿中，约有40%可精准检测到融合基因转录本^[1]。例如RUNX1-RUNX1T1(AML1-ETO)、CBFB/MYH11以及MLL基因重排，灵敏度为0.01%； FLT3内部串联重复突变与RAS突变也是MRD检测靶点之一，但假阴性较高；而NPMI基因突也是PCR检测靶点之一，与Ig、TCR基因重排一致，仅仅在10%的AM患儿可检出，因而临床应用具有显著局限性。在ALL中WT1基因表达过度，通过PCR检测水平变化可作为评估MRD及危险度的首选，而儿童ALL WT1基因表达过度的比例与PCR检测的灵敏度仍需借助大批样本予以深入研究。现阶段ALL患儿检测MRD最为基本的方法即是RQ-PCR，主要检测异常融合基因转录本，敏感性达0.0001%，但难以融合基因予以联合检测，该技术应用于ALL患者仅具有25%左右。

1.2多参数流式细胞仪(FCM)

临床大量研究证实FCM检测LAIPs的灵敏度为0.01% ~0.001%，＞90%的ALL患儿主张使用FCM测定MRD。药物治疗、白血病细胞的异质性可致使LAIPs并发抗原漂移（免疫表型变动）。此时凭借初诊时建立模板，无法用于评估MRD，增加结果假阴性检出率。糖皮质激素可致使B-ALL患者血清CD10、CD34表达弱化。源自不同正常法（different fromnormal）是使用FCM检测MRD方法之一，主要是使用已明确的健康群体的骨髓细胞免疫表型谱，检测并区分异常白血病细胞，优点在于无需考虑初诊时患者LAIPs，防止抗原漂移所致假阴性，但改法相对耗时较大。有研究表明，急性髓系白血病中，增加机体髓样抑制性凝集素C、CD-123至FCM的抗体组合中，可避免抗原漂移导致检出为假阴性^[2]。而应用于ALL患儿中尚不具相关报道。综合而言，适当增加抗体组合，联合使用其他检测手段，有助于提升MRD检出阳性率。

1.3 二代测序(NGS)

由于NGS可采用共有引物实现快速、平行测序，因此无需耗费大量时间精力建立患儿者特异性引物，相较于PCR更为便捷。加之，所选样本中样本中靶基因座的所有重排均正序排列，NGS可反馈连带至生理B细胞库或T细胞库对诊断具辅助价值的有效信息。Fabio等人^[3]对比FCM、NGS检测ALL MRD，其表明NGS相较于FCM之于预测病症复发率、复发区间及3年总生存率更为精确，尤其是MRD阴性患儿(复发率0% ：15.44% ；3年总生存率97.26% ：81.59% )。并且，移植后NGS检测MRD 相较于FCM预测复发更为便捷，尤其是移植后30 d及30d+。唐雪等人^[4]对比分析PCR与NGS检测MRD预测复发结果，也表明NGS更优于PCR。借此分析可表明，NGS相较于PCR、FCM灵敏度相对更高，预测ALL的危险分层、复发预测效果更优，但存在局限性在于针对生物学信息、校准器使用、临床经验、后期数据处理、经济适用性、标本污染等问题还需进一步深入拓展研究。

结语

综合来说，FCM、PCR、NGS三种检查方法检测MRD均具特点，FCM检测MRD可将骨髓作为首选标本，但T-ALL患儿的外周血仍可作为MRD检测标本；ALL患儿检测MRD可针对其实现危险程度分级、评估疗效，以选择不同或优化治疗策略，实现针对性的个体化治疗。ALL患儿检测MRD还可为评估、判断预后提供一定价值；而NGS技术应用于ALL患儿检测MRD的特异度、灵敏度相较于FCM、PCR更高。临床应对三种检测方法的优势、局限性均进行拓展分析，为临床及时、安全且有效治疗MRD提供实质性的辅助价值。

参考文献

[1]徐梅珍. Screening of adult Ph-like acute lymphoblastic leukemia by multiplex real-time quantitative PCR[J]. China Medical Abstracts(Internal Medicine),2018,01:57-58.

[2]代晓宇,路媛,王志恒,李明卓,司书成,李吉庆,井明,薛付忠. 血常规数据判别骨髓增生异常综合征和急性髓样白血病的应用价值[J]. 山东大学学报(医学版),,:1-7.

[3]Efficace Fabio,Cottone Francesco,Sparano Francesco,et al. Patient-reported outcome assessment in acute leukemias: Moving beyond the barriers.[J]. Cancer,2018,12414:.

[4]唐雪,宪莹,温贤浩,等. 流式细胞术及PCR技术在儿童急性B淋巴细胞白血病微小残留病监测中的价值[J]. 现代医药卫生,2018,04:502-505.