sFrp3 RNA干扰对小鼠早期牙齿发育的影响研究

sFrp3 RNA干扰对小鼠早期牙齿发育的影响研究

黄瑶

苏州大学，江苏苏州， 215000

【摘要】：临床研究发现，sFRP3蛋白在小鼠牙乳头间质中呈高表达水平，且通过外源性sFRP3蛋白能够影响小鼠磨牙发育状况，使小鼠牙齿发育规格低于平均水平，由此可见sFRP3蛋白在小鼠牙齿发育中具有重要作用。文章主要针对这一结论展开分析。

【关键词】：sFRP3；RNA干扰；小鼠牙齿发育；

分泌型卷曲相关蛋白（SFRPs）是Wnt信号拮抗因子，哺乳动物体内存在五种SFRPs，其中sFRP3蛋白具有多种生物活性。哺乳动物器官发育可分为三个阶段，首先为在正确的位置生化，之后形成器官雏形，最后分化为器官特有的细胞，最终形成了不同的组织和器官^[1]。牙齿属于上皮-间充质器官，以小鼠为例，牙齿的形成中主要是由预定发育呈牙齿的组织起到主导作用。而现代研究发现，sFRP3蛋白对小鼠牙齿发育具有重要影响^[2]。

一、sFRP3蛋白与Wnt信号通路

小鼠胚胎在发育第九天就已经形成了第一鳃弓，牙齿形成部位的确定时在第10天或更早，在第11天就已经出现牙上皮局部增厚改变，在此过程中，牙上皮细胞会沿着顶端-基底轴生长并形成牙板。当增厚牙上皮组织不断增殖并形成牙蕾之后，周围间充质细胞出现高度聚集的状态。在此过程中，上皮牙蕾基底层细胞仍保持原状，在第14天上皮组织经过折叠之后会形成釉结节，其实上皮组织聚集的暂时结构，会产生特定信号分子的表达，如Shh、BMP4以及FGF4等因子。在第16天时，上皮组织的成釉细胞与间充质的牙本质细胞会产生分化改变，从而分泌釉质与牙本质，最终形成了牙髓与牙槽骨。

牙原基中存在预定发育呈牙齿的组织，当与非牙齿组织结合时，具有让非成牙组织形成牙齿的能力。目前临床胚胎学研究表示，诱导牙齿发育的首要组织为牙上皮组织，其次为牙间充质。在胚胎发育的第10天到第11天，牙上皮与非牙齿间充质组织重组之后就能够形成相应的牙齿结构。因此有待牙齿发育的主要组织在于牙上皮组织。现代分子生物学研究指出器官发育过程中连续作用是信号传递生长因子发挥的作用，如骨形成蛋白、成纤维细胞生长因子、刺猬蛋白家族和Wnts等，在组织中的传递能够激发相应的生物学反应，从而诱导细胞分化与器官形态的生成。临床研究发现，小鼠牙胚发育早期中可观察到BMP4、BMP2等因子的表达，其中BMP4参与牙胚位置与形态的去顶，BMP2则能够影响成牙本质细胞的分泌功能。临床研究指出，无论是在牙胚发育或面突发育过程中，BMPs家族均有着重要作用。

器官发育是一个复杂过程，其中信号调控机制具有重要的作用。Wnt信号通路被认为是胚胎发育过程中对组织器官形成与分化起到重要引导作用。Wnt基因家族与果蝇Wg基因存在同源性，在不同器官与细胞形成过程中会产生特殊的信号。Wnts是牙齿发育过程中的常见生长调节因子，因此研究sFRP3蛋白对小鼠牙齿发育影响中必然会涉及到Wnt信号通路。Wnt信号通路对于胚胎发育的诱导与分化是其主要功能，其主要传导方式可以分为三种，第一种是将信号传导至细胞核内，从而激活目标基因并促使其转录，这也是Wnt信号主要的传导通路；第二种是将信号传导入细胞质中，激活细胞骨架系统的重组，促使细胞极化并产生新的形态，该通路也被称为平行极性通路；第三种则是Wnt/钙离子通路^[3]。目前临床研究认为Wnt信号通路要想发挥其作用需要同时与LRP5/6和Frizzled结合，从而形成主要通路^[4]。Wnt信号通路拮抗因子主要是通过阻止Wnt配体与Frizzled蛋白结合从而阻断信号传导，且根据阻断方式的不同可以分为两种，一种是DKK家族，其主要是通过阻断Wnt受体复合物与LRP5/6的结合，从而阻断第一种Wnt信号通路，但对平行极性信号通路无影响^[5]；另一种就是sFRP蛋白，其能够竞争性与Wnt受体结合，能够阻断第一种和第二种信号通路，并且sFRP蛋白之间的相互作用也对Wnt信号通路有较大的影响^[6]。

目前在哺乳动物中发现了五种sFRP蛋白，且临床研究显示sFRPs蛋白能够直接作用于Wnt信号通路，但是也有学者认为其可能是与Frizzled蛋白受体结合形成的复合物产生的拮抗作用^[7]。Wnt信号通路对小鼠牙齿发育的影响主要是通过激活lef1表达从而激活多个信号通道^[8]。同时，过度表达的DKK1会使得小鼠牙齿发育水平受到影响。多个研究指出Wnt基因表达水平对于Wnt信号通路对于小鼠牙齿发育具有重要影响^[9]。有学者认为Wnt信号对牙形状发育具有重要影响，其中Wnt-10特异性定位于牙源性上皮细胞，而Wnt-3局限于釉节表达^[10]。有研究通过观察发现，小鼠牙齿发育过程中早期sFRP3蛋白以P-D梯度在牙间充质中表达^[11]。Wnt-7b通过Shh信号通路参与牙胚外层界限确定，并且在牙齿形成区域的异常表达能够有效抑制Shh表达，对牙齿形成产生抑制效果。

二、sFrp3 RNA干扰对小鼠早期牙齿发育的影响

研究某个基因在器官发育中的表达地位主要是通过功能性获得或功能性缺失研究来观察，基因过度表达与缺失这两种方法对于器官发育情况都有直接影响，因此可以观察该基因对发育的影响。基因的过度表达可以通过注射外源性蛋白或增肌基因拷贝数量来实现，基因缺失则可以通过靶向剔除基因培育转基因小鼠来观察，从而研究该基因对气管发育的影响。但是临床研究发现部分基因（Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3、Wnt-4等）剔除的小鼠在早期就会出现死亡现象，因此无法对该基因的功能进行观察。近些年来临床研究发现生物体内存在RNA干扰的现象，是指生物体内的外源性或内源性双链RNA在进入细胞之后，主要是通过识别含有序列的mRNA并与之结合在酶的作用下形成mRNA，且对基因表达造成影响，这一现象被称为RNA干扰^[12]。RNA作用主要是通过短干涉RNA结合核酸酶复合物形成RNA诱导沉默复合体，该物质对于靶RNA具有十倍于切割的作用，能够破坏特定目的的基因转录mRNA^[13]。RNA干扰技术是临床研究的常用工具，在基因功能、疾病治疗等方面均有较好的应用效果^[14]。文章主要从sFrp3 RNA干扰对小鼠早期牙齿发育的影响展开分析。有研究用病毒感染小鼠牙间充质细胞，在感染10天后牙上皮重组，且最终成牙率仅有50%，与正常水平相比明显升高，这可能是由于sFrp3是Wnt信号拮抗剂，通过抑制sFrp3表达水平能增强Wnt信号通路。

临床通过观察发现，慢病毒干扰小鼠磨牙牙胚体内培养2天之后进入牙蕾晚期，而空白对照组才到蕾状早期，继续观察4天之后，观察组小鼠牙胚发育进入帽状晚期而空白对照组才进入帽状早期，由此可见通过RNA干扰小鼠下颌磨牙牙胚中sFrp3表达水平，能够加速牙齿发育水平。

临床研究发现Wnt信号系统对小鼠牙齿发育有着直接影响，并将目标锁定在sFrp3。通过sFrp3 RNA干扰发现，sFrp3在小鼠发育第11天就开始表达，同时多个Wnt基因在牙上皮与牙间充质中表达，若sFrp3表达水平下降，对于Wnt基因对小鼠牙齿发育调节作用有着直接影响，从而导致牙齿发育出现异常反应。目前临床对于sFrp3 RNA干扰中主要是通过慢病毒介导RNA干扰抑制sFrp3表达进行观察。慢病毒属于逆转录病毒亚属，能够转染分裂与非分裂细胞并稳定表达基因，无免疫应答反应，并且能够转染多种组织，具有多种优点。虽然有学者认为RNA干扰过程中容易产生sFrp3表达量差异，从而导致参与反应的总RNA不等量，因此可以通过内源控制物来解决不同样本产生的差异，提高观察结果的稳定性。有研究通过实验观察发现，空白组小鼠sFrp3相对表达量为100%，模型组小鼠sFrp3相对表达量为17.3%，标准曲线方程测得R²为0.968，说明LV-shsFrp3能够抑制小鼠牙胚组织中sFrp3基因表达水平，并在进一步的观察发现，模型组小鼠体外培养96h后牙胚发育到帽状早期，而空白组小鼠发育到蕾状早期，由此可见sFrp3表达对小鼠牙齿发育有着明显的影响。

小鼠牙齿发育和其他哺乳动物器官发育相同，主要是依赖于上皮组织和间充质的相互作用形成的，其中涉及到多种信号通路，具体表现为可溶性蛋白质生长因子在细胞与组织见的扩散^[15]。Wnt基因在牙齿发育期的大量表达同时也会引起sFRP蛋白的表达，从而影响了牙齿的发育水平^[16]。临床研究指出，部分小的双链RNA能够特异性阻断特定基因表达，从而促使mRNA降解，诱导细胞出现特定基因缺陷^[17]。由于RNA干扰具有较高的特异性和效率，因此基因恢复正常表达水平之前，会维持多个细胞分裂周期，能够为sFRP3蛋白研究提供有效支持。有研究通过观察发现，小鼠牙齿不同发育阶段过程中下颌磨牙以及牙间充质细胞中sFRP3蛋白表达水平的下降能够加速牙齿发育^[18]。sFRP3蛋白作为Wnt信号拮抗因子，Wnt信号通路在牙齿发育中的作用主要是让牙齿发育停滞。Wnt信号通路的激活能够促使间充质细胞表达lef1，从而诱导多个信号通路的激活^[19.20]。而口腔中DKK1过度表达会让小鼠牙齿发育进入停滞期。同时，临床多个研究指出Wnt基因在小鼠牙齿发育中起到多重作用，且牙齿早期发育中也存在sFRP蛋白表达，通过分析sFRP蛋白与牙齿发育之间的关系能够了解Wnt信号在牙齿发育中的作用^[21]。sFRP3蛋白以及Wnt-5a在小鼠牙乳头间质中呈高表达水平，外源性sFRP3蛋白的应用能够抑制Wnt信号传导，从而导致小鼠磨牙发育受到较大的影响，牙齿发育尺寸低于平均水平，这可能是由于Wnt信号能够让细胞质累及更多的β-catenin，能够激活细胞核中的转录因子，加速细胞增殖水平，从而加速牙齿的发育，而sFRP3蛋白高表达水平会抑制Wnt信号传导，从而阻碍小鼠牙齿发育，使得小鼠磨牙发育速度减缓

^[22]。

釉结节是牙尖形成的重要组织结构，能够促使上皮细胞聚集并表达特定的信号分子，因此也被认为是牙尖形成的重要信号调控机构^[23]。抑制sFRP3蛋白表达水平能够加速牙齿发育，促使Wnt信号发挥作用，激活平行极性信号通路，促使细胞骨架系统重新组合，协调上皮细胞的新形态的转变，促使上皮细胞更快分化为柱状细胞。有学者^[24]指出，牙上皮组织以及牙间充质细胞中存在多种Wnt基因、Wnt受体、Wnt配体以及Wnt信号通路，说明牙齿发育存在多种信号通路。有研究^[25]通过抑制小鼠下颌磨牙sFRP3蛋白表达水平，发现能够促进磨牙发育状况，这与同类型文献研究结果一致，通过抑制牙间充质sFRP3蛋白表达水平对于成牙有一定的调控作用但是对成牙无抑制效果，由此可见Wnt信号主要在牙齿早期发育起到重要的作用。有研究^[26]通过观察发现，sFRP3 RNA干扰会影响其在小鼠下颌磨牙牙胚组织的表达水平，使得小鼠牙齿发育加速一段时间，而在慢病毒干扰的影响下，小鼠磨牙发育停滞，对照组小鼠磨牙发育速度则更快，在经过1周之后，两组小鼠均出现完整的牙齿结构，但是实验组小鼠已经形成牙本质，而对照组小鼠尚未出现牙本质，再经过1周的观察后，观察组牙本质细胞的密度要高于对照组，由此可见sFRP3 RNA干扰能够加速小鼠牙齿发育，但是牙齿形态带下方面无明显影响。

结束语

临床研究发现sFRP3蛋白是Wnt通路抑制因子，目前临床多篇研究指出通过抑制sFRP3蛋白表达水平，能够加速牙齿生长速度，但是由于牙齿发育早期Wnt-5a与sFrp3表达区域重叠，仍需要针对Wnt-5a进行基因过度表达与缺失的研究，分析其对小鼠牙齿发育的影响，从而分析Wnt-5a与sFrp3之间的相关性，从而进一步探讨这些因素对牙齿发育的影响，需要不断的提出新的项目对这些因子进行进一步的分析。

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作者简介：黄瑶（2001.6-），女，汉族，江苏省常州市人，苏州大学，本科生，215000，研究方向：口腔医学。