兔不同负重部位关节软骨缺损自体修复差异的比较

兔不同负重部位关节软骨缺损自体修复差异的比较

檀臻炜 ， 李健， 汪丙昂，娄延举，陈施展 *

西部战区空军医院骨科，四川成都， 610021

【摘要】 目的 比较实验兔不同负重关节软骨缺损的机体自我修复能力，探讨力学刺激在软骨自我修复中的作用。方法 建立兔膝关节的股骨髁后部、股骨髁前部、股骨滑车及肩关节的肱骨头等不同负重关节部位，深达软骨下骨（未穿透软骨下骨）的全层缺损软骨，并于术后8周进行大体标本、组织学评价，比较不同负重关节区域的自体软骨修复效果。结果 术后8周取材时均可见缺损部位有透明样组织长入，不同负重部位的自体软骨修复效果有较大差别，从修复效果优到差依次为股骨髁后部、股骨髁前部、股骨滑车和肱骨头处。结论 正常负重状态下的适当压缩载荷对关节软骨修复产生积极的正向作用，从而造成较大的软骨缺损自体修复效果差异。

【关键词】股骨；骨软骨损伤；软骨组织工程

关节软骨主要承受流体剪切、静水压力、压缩等多种力学载荷^[1],力学刺激是促进关节软骨形成和保持软骨细胞正常生理表型的重要因素^[2]，因此研究生物力学刺激及力学载荷变化对软骨组织功能的影响具有十分重要的意义。本课题研究比较兔膝关节不同负重部位软骨缺损的自体修复效果的差异，探讨正常负重状态下膝关节软骨承受的力学刺激对软骨缺损自体修复再生的影响。

1. 材料与方法

1 主要仪器：动物称重电子称，牙科电钻；倒置荧光显微镜（Leica-CTR-4000），激光共聚焦显微镜（Leica-TCS-SP5），冰冻切片机（CM1950），封闭式全自动组织脱水机（TSJ-Ⅱ型）、组织包埋机（BMJ-Ⅲ型），手术器械等。

2 主要试剂：青霉素（Hyclone），3%戊巴比妥钠；α-氰基丙烯酸正丁酯；组织标本固定液（4%多聚甲醛固定液），无水乙醇，OCT包埋剂，甲苯胺蓝（TB），番红 O（SO），I型胶原一抗、二抗等。

3. 实验动物：采用新西兰大耳兔，3-6月龄，性别不限，体重2.3-3.2Kg（四川大学动物实验中心提供）。

4 不同负重部位软骨缺损的自体修复差异比较：术后8周全部处死实验兔，取材时观察大体标本软骨缺损部位的自体修复情况并拍照。然后对各部位分别取材并分成三组，A组为完全不负重的肱骨头部位，B组为部分负重的股骨滑车部和股骨髁前部，C组为完全负重的股骨髁后部，经固定、脱钙、脱水、石蜡包埋切片进行HE、甲苯胺蓝、番红固绿染色，光镜下观察软骨缺损自体修复情况。

二、结果

1 离体后大体标本观察及比较：术后8周取材时均可见缺损部位有不同程度的透明样组织长入，但完全不负重的肱骨头部位未填满缺损部分，与周围软骨组织整合差；完全负重的股骨髁后部可见透明样软骨组织已基本覆盖缺损部分，与周围软骨组织整合良好；部分负重的股骨滑车部和股骨髁前部介入前两者之间，且这两部位差异不明显（见图3、4）。

图 3：股骨髁后部软骨缺损的自体修复； 图 4：股骨髁前部及滑车部软骨缺损的自体修复

2 HE染色结果：肱骨头部位可见新生组织表面极不光整，大部分为非软骨细胞；股骨髁后部可见新生软骨的4 层结构清晰，软骨表面光滑、完整，完全为透明软骨细胞，呈柱状排列，基质和新生软骨细胞呈均匀嗜碱性染色；股骨滑车部和股骨髁前部可见新生软骨表面比较光整，稍有台阶样不平，大部分为透明软骨细胞，细胞呈柱状排列，基质染色轻度减退，软骨细胞呈强嗜碱性染色（如图5）。

图 5：自体软骨修复后8周，HE 染色比较三组不同负重部位的修复效果（40，100 及200倍）

3 甲苯胺蓝染色结果：肱骨头部位可见新生组织表面极不光整，组织内有空泡样结构，大部分为非软骨细胞，无基质异染；股骨髁后部可见新生软骨表面稍有不平，新生透明软骨细胞呈柱状排列，细胞核染色清晰、呈蓝色，基质染色呈淡蓝紫色；股骨滑车部和股骨髁前部可见新生软骨表面有台阶样不平，大部分为透明软骨细胞，呈柱状排列，基质染色轻度减退（如图6）。

图 6：自体软骨修复后8周，甲苯胺蓝染色比较三组不同负重部位的修复效果（40，100 及200倍）

三、讨论

关节软骨主要承受着多种力学载荷,力学刺激对关节软骨的组织发育和功能维持及移植软骨和宿主软骨的有效整合具有重要作用，其中负重状态下的压缩载荷是软骨组织工程构建及相关生物力学研究中常采用的力学激励形式, 能使工程软骨的杨氏模量、II 型胶原和软骨寡聚基质蛋白的分泌量显著增加， 同时Connelly等^[3]有关细胞形变的研究表明: 动态压缩载荷能引起细胞和细胞核变形，使细胞出现径向扩张, 产生径向和轴向的拉伸应变, 从而影响和调节干细胞的分化过程。

Shapiro等研究结果显示^[4]：直径在3mm以下、深度不达软骨下骨的软骨缺损，建模6周后不给予任何干预，软骨缺损便能自行部分或全部修复。本实验建立的直径为3mm、深达但不破坏软骨下骨（约3mm）的软骨缺损没有任何材料修复的同样证实了该结论。本实验的前期研究

^[5]：通过兔膝关节软骨受力有限元分析得到软骨力学云图，并得到股骨内髁后部中的软骨应力最大、其次为股骨髁后部、最小为股骨滑车部位的结论。在本实验中发现不同受力部位导致机体自体修复程度也有很大差别：完全不负重的兔肩关节肱骨头处的软骨修复效果最差，股骨滑车和股骨髁前部的软骨修复效果略好于肱骨头处的修复效果，股骨滑车和股骨髁前部这两者之间差异不明显，但这两者明显差于股骨髁后部的软骨修复。本研究同样证实了Baker等在2010年的研究结果^[6]：即正常负重状态下的适当压缩载荷对关节软骨修复产生积极的正向作用。

通过本部分的实验兔不同负重部位的软骨缺损及自体修复的观察和研究，证实了正常负重状态下的适当压缩载荷对关节软骨修复产生积极的正向作用，为组织工程软骨的术后适当力学刺激产生积极作用提供了理论支持。

参考文献：

1.Decroos A J N, Petrera M, Park S, Kandel R A, Theodoropoulos J S. 2016. Mechanical stimulation enhancesintegration in an in vitro model of cartilage repair. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc., 24: 2055-2064.

2. Wang N, Tytell JD, Ingber DE. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2009, 10(1): 75-82.

3. Connelly J T, Vanderploeg E J, Mouw J K, Wilson C G, Levenston M E. Tensile loading modulates bone marrow stromal cell di®erentiation and the development of engineered ¯brocartilage constructs.Tissue Eng. Part A, 2010, 16: 1913-1923.

4. Shapiro F, Koide S, Glimcher MJ. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage. Journal of Bone & Joint Surgery American Volume. 1993;75(4):532-53.

5. 檀臻炜, 汪丙昂, 姚一民,等. 兔膝关节力学有限元分析及软骨缺损模型的建立[J]. 西南国防医药, 2018, 28(12):87-91.

6.Baker B M, Shah R P, Huang A H, Mauck R L. 2011. Dynamic tensile loading improves the functional properties of mesenchymal stem cell-laden nano ber-based brocartilage. Tissue Eng. Part A, 17: 1445-1455.

作者简介：檀臻炜，男，汉，1980年6月生，安徽池州人，硕士，副主任医师，研究方向：创伤与关节骨科。通讯作者简介：陈施展，男，汉，1966年10月生，广东云浮人，本科，主任医师，研究方向：脊柱外科。

基金来源：四川省医学会青年创新课题，Q18061，甲基丙烯酰胺化胶原水凝胶复合种子细胞修复兔膝关节不同负重部位软骨缺损的实验研究