COX—2基因多态性与帕金森病易感性的相关性研究

COX—2基因多态性与帕金森病易感性的相关性研究

戴毅 郭起峰 郑新莉 许娟 蔡灵钰 吴玉泉 成军 陈彧通讯 武凤英

解放军联勤保障部队第 903医院神经内科 浙江 杭州 310004

摘要：目的：本文旨在分析通过对环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2)基因启动子多态性与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的关联分析，阐明PD患者常见的基因型，为PD诊断治疗提供临床依据，探索PD诊断与治疗的新方法。方法：通过应用病例对照的研究方法，收集68例PD患者及68例年龄、性别相匹配的健康对照组的空腹静脉血并提取DNA样本,分别使用多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)和PCR-TaqMan探针检测法测定和分析COX-2基因启动子区多态性的基因分型，并对结果进行统计学分析。结论：GIGYF2基因rs532658514位点GG基因型和rs1190036525位点AC基因型与帕金森病发生有显著相关性。

ABSTRACT: Objective: to analyze the association between the polymorphism of COX-2 gene promoter and Parkinson's disease (PD) in patients with Parkinson's disease (PD) , to clarify the common genotypes of PD, to provide clinical evidence for diagnosis and treatment of PD, and to explore new methods of diagnosis and treatment of PD. Methods: DNA samples were collected from 68 PD patients and 68 age-and sex-matched healthy controls. The polymorphisms of COX-2 gene promoter region were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and taqman probe respectively, and the results were analyzed statistically. Conclusion: GENOTYPE GG at RS532658514 and genotype AC at RS1190036525 of GIGYF2 gene are significantly associated with the development of Parkinson's disease.

前言：帕金森病（PD）是一种退行性神经系统疾病，起发病率仅次于阿尔茨海默病。患者常伴有锥体外系反应，部分患者存在运动功能障碍的情况。过去的大量研究表明PD的发生与神经、抗体、细胞因子尤其是炎症反应等多种因素相关联。COX-2作为最初反应物参与人体内多种物质如花生四烯酸（AA），前列腺素（PG）等的合成[1]，这些物质大多与炎症反应的发生与消除相关联。过去的一些研究表明COX-2与神经系统病变存在相关性，进而与退行性神经系统疾病的发生和发展相关联，COX-2在正常组织中表达较低，但在病变组织表达显著升高.[2]帕金森病患者脑内黑质部分可见COX-2和前列腺素E2显著升高，这显示COX-2可能通过某些机制影响帕金森病的发生和进程。过去已有研究和meta分析表明GIGYF2一些位点的基因突变的发生可导致帕金森病的发生。研究通过建立正常人群和在我院确诊并治疗的PD患者DNA样本中COX-2基因启动子多态性数据库，并采用统计学方法进行对比分析，研究基因启动子的基因多态性，从遗传基因的层面探究阐明PD的发病机制，为PD的临床诊断与治疗提供依据。

1.资料与方法

1.1研究对象

选取2017年5月至2020年1月在我院门诊就诊并确诊继而进入我院治疗的68名病人，严格按照英国帕金森脑库标准确诊断并确诊，询问病史，并排除并排除已患肿瘤或有肿瘤病史的患者，作为A组。同时选取同期来我院体检的，询问并排除肿瘤病史，同时自愿作为志愿者参与此项研究的68名健康人作为B组。

二组纳入标准：年龄大于十八岁，彼此间无血缘关系，知情并自愿同意参与此项研究。此项研究经本院伦理委员会批准。排除标准：患有肿瘤或有肿瘤病史，药物中毒导致类帕金森病者，排除临床资料不全患者，排除未签署知情同意书者。

二组一般资料对比无差异（P>0.05）。

1.2基因多态性分析

要求患者与健康志愿者采血前一天空腹不少于8小时，空腹在第二日上午八时从肘部取静脉全血5ml，取得的静脉血置于含有EDTA的抗凝真空采血器中，标本采集后立刻上下颠倒5-7次以防止血液发生凝集。采取传统的氯丙醇/氯仿提取方法，对样本中DNA标本进行提取，提取后样本保存于零下二十度冰箱。通过使用中国PHYGENE公司生产的PH0213全血基因组DNA提取试剂盒提取人全血基因组DNA，各个步骤均严格按照产品说明书及相关规程说明进行操作，对标本分别采取聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）以及TaqMan探针检测法。通过美国国立生物技术信息中心公共数据库，对基因序列进行检测，同时查阅国内外相关文献，根据引物设计的原则进行引物设计。首先采用PCR-RFLP进行GIGYF2基因多态性分析，采用20微升PCR反应体系，对PCR扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，将测序结果与NCBI在线进行序列对比。

1.3调查资料

调查全部入选者包括病例组和对照组的所有资料，包括性别，年龄，种族，体重指数，既往病史及家族遗传病史。同时记录患者的病程。

1.4统计方法

采用 SPSS 18.00对数据进行统计分析，计量数据与计数数据以(x±s）与%表示，对比采用卡X²分析、t检验，相关性分析采用直线相关分析，P<0.05 为差异显著。COX-2启动子区域是否符合哈迪-温伯格平衡采用X²检验。基因多态性与PD发生的相关强度分析采用95%可信区间的OR值评估。就用软件Haploview测量连锁不平衡和单倍型的作用。

结果

2.1两组患者一般临床资料比较

本次研究病例共136例。其中男性患者32例，女性患者36例，男女比例1：0.88，对照组共68例，其中男性37例，女性37例，男女比例1:1。年龄为平均年龄61.62岁.病例及对照组性别构成检验后，X²=0.105, P=0.09，提示差异无统计学意义，(p >0.05)。年龄符合正态分布，经t检验后提示差异无统计学意义。

2.2遗传平衡检验

病例组与对照组COX-2基因rs532658514位点和rs1190036525位点的基因型分布符合GIGYF2的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。表明本实验所选样本基因型频率处于平衡状态，即具有群体代表性。

2.3COX-2基因rs532658514位点和rs1190036525位点测序结果

本次研究送检样本共计136例，其中病例组共计68例，rs532658514位点GG基因型118例， CG基因型18例。rs1190036525位点AC基因型121例，GC基因型15例。对照组共计68例，rs532658514位点GG基因型7例，CG基因型129例。rs1190036525位点AC基因型4例，GC基因型132例。

图1 PCR产物结果图

A.rs532658514（602bp）位点PCR扩增后产物电泳图

B.rs1190036525（353bp）位点PCR扩增后产物电泳图

图二.rs532658514位点测序图

图三.讨论.rs1190036525位点测序图

2.4PD组和对照COX-2位点基因型分布和等位基因分布频率

2.4.1PD组和对照COX-2 rs532658514位点基因型分布和等位基因分布频率

PD组和对照COX-2 rs532658514位点GG,CG基因型的频率分别为86.8%，13.2%和5.1%，94.9%，等位基因G,C的频率分布为93.4%，6.6%和52.6%。47.4%。PD组和对照COX-2 rs532658514位点基因型分布频率比较(X²=0.115,P=0.134)，差异有统计学意义，等位基因频率比较(X²=0.101,P=0.164)，差异有统计学意义

2.4.2PD组和对照COX-2 rs1190036525位点基因型分布和等位基因分布频率

PD组和对照COX-2 rs1190036525位点AC,GC基因型的频率分布为89.0%，11.0%和2.9%。97.1%。等位基因G,C,A的频率为5.5%，50.0%，44.5%和48.5%，50.0%，1.5%。PD组和对照COX-2 rs1190036525位点基因型分布频率比较(X²=0.087,P=0.166)，差异有统计学意义。等位基因频率比较(X²=0.076,P=0.214)，差异有统计学意义

2.5相关性分析

数据分析的结果显示，在136例入选者中，对检验结果进行直线分析，显示GIGYF2基因rs532658514位点GG基因型和rs1190036525位点AC基因型与帕金森病发生有显著相关性.

讨论:

帕金森病是临床较为神经系统疾病，其主要病理表现大脑黑质多巴胺能神经元的逐渐丧失，多巴胺缺失导致基底神经节环路失调，患者出现抑郁、焦虑、幻觉、运动迟缓、姿势不稳、肌肉僵直、静止性震颤等症状，可严重影响患者的生活质量，给患者家庭造成巨大的负担[3,4].其发病机制仍有待研究，现有药物治疗只能缓解症状，不影响疾病的发展进程，且可能出现耐药。现有研究认为帕金森病的发生和发展与家族遗传，炎症反应，细胞因子等因素相关联。

COX-2参与PG,AA等体内多种重要物质的合成，作为底物参与PG合成的第一步，是炎症反应中PG的重要来源，由于胰岛素样生长因子-1在中枢神经系统胰岛素信号传导中的作用，GIGYF2可能参与PD的发病机制[5-6]。过去已有研究显示COX-2启动子区域的基因多态性可能与帕金森病的发生相关。过去有研究显示不同人种的COX-2启动子区域的基因型可能存在差异，因此COX-2启动子区域的基因型与帕金森病的关联性还有待进一步研究。

参考文献：

[1]T. Chen, E. Li, Establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mammals, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 301 (2006) 179–201.

[2] Baker E, Sims R, Leonenko G, et al. Gene-based analysis in HRC imputed genome wide association data identifies three novel genes for Alzheimer's disease[J]. PLoS One, 2019, 14(7): e0218111

[3]Yao X, Risacher SL, Nho K, et al. Targeted genetic analysis of cerebral blood flow imaging phenotypes implicates the INPP5D gene [J]. Neurobiol Aging, 2019, 81: 213-221

[4]Gajewski TF, Schreiber H, and Fu Y-X (2013). Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat. Immunol. 14, 1014–1022.

[5]Wang F, Ji Y, Chen X, et al. ABCA1 variants rs2230806 (R219K), rs4149313 (M8831I), and rs9282541 (R230C) are associated with susceptibility to coronary heart disease [J]. J Clin Lab Anal, 2019, 33 (6): e22896

[6]Stamati P, Siokas V, Aloizou AM, et al. Does SCFD1 rs10139154 Polymorphism Decrease Alzheimer's Disease Risk? [J]. J Mol Neurosci, 2019, 69(2): 343-350

基金项目：杭州市卫生科技计划一般项目（2017B68）