知母化学成分研究

知母化学成分研究

崔永祥

瀚晖制药有限公司 浙江 杭州 311404

摘要：为了研究知母中的化学成分，将此药材乙醇提液浓缩后，浸膏用水溶解，然后用乙酸乙酯及正丁醇来萃取。之后根据性质采用大孔树脂吸附色谱，硅胶柱色谱、MCI柱色谱、ODS反相色谱以及凝胶柱色谱等方法来分离、纯化，并根据不同的理化性质、光谱数据进行化合物结构的鉴定。最后分离出6个化合物，分析鉴定出4个：化合物1为芒果苷，化合物2为β-胡萝卜苷，化合物3为知母皂苷C，化合物4为知母皂苷D。

关键词：知母；化学成分；甾体皂苷；知母皂苷C；知母皂苷D

第一章 实验部分

1.1实验仪器

ESI-MS 使用 Agilent 1100 Series LC/MSD Trap SL 质谱仪测定；核磁共振使用 Bruker DRX-500 型核磁共振仪测定。

薄层色谱用硅胶 GF₂₅₄ 和柱色谱用硅胶 (青岛海洋化工有限公司)；D101大孔树脂 (青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20 (Pharmacia 公司)；大孔树脂(青岛海洋化工有限公司)；75-150 μm MCI 树脂 (日本三菱化工株式社)。柱色谱所用试剂均为分析纯。

1.2实验过程

取10Kg干燥的知母药材（300g留样），用45 L的75％的乙醇回流提取，浓缩提取液，重复3次，合并提取液，蒸干得粗浸膏6Kg，加水溶解后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯、正丁醇、水三个部位。

取乙酸乙酯部位的浸膏，用不同梯度（100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1和纯甲醇）的二氯甲烷-甲醇系统冲硅胶柱，在1:1处得到化合物1。之后取10:1梯度下来的样品用二氯甲烷-甲醇1:1过凝胶柱Sephadex LH-20纯化，点板合并后流分经薄层色谱显示为单点，进一步确认分别为化合物2.

取正丁醇部位的浸膏，过大孔树脂，分别以水、30％、50％、70％、95％的乙醇进行洗脱，每一梯度流出成分均做薄层色谱检验，并根据检验结果进行合并，其中70%流分过MCI树脂（不同梯度的甲醇洗脱），ODS柱（甲醇-水按比例洗脱）进行分离，得到化合物3。之后依次过硅胶、ODS反相及凝胶柱Sephadex LH-20，得到化合物4.

1.3化合物的结构鉴定

1.3.1化合物1的鉴定

化合物1呈淡黄色针状结晶，略溶于甲醇、乙醇、水、可溶于热稀甲醇、不溶于非极性溶剂。点板呈黄色，有暗斑，有橘红色荧光。用TLC薄层板色谱以及反相色谱，与芒果苷对照品对照，显现出相同的色谱行为（BAW系统Rf =0.59,甲醇-水= 8:3，Rf =0.88）。所以化合物1鉴定为芒果苷。

1.3.2化合物2的鉴定

化合物2为白色粉末，溶于甲醇和吡啶，熔点为 289-291℃。醋酐-浓硫酸（Liebermann-Burchard） 反应和Molish反应均为阳性，推测可能为甾体皂苷类化合物。

此外，化合物2在硅胶薄层色谱上，与β-胡萝卜苷对照品品对照，之后显色。Rf值与对照品一致 [BAW系统，Rf =0.7; C/M=5:1,Rf =0.71;甲醇：水=8:3，Rf =0]。故化合物2被鉴定为β-胡萝卜苷(β-daucosterol)。

1.3.3化合物3的鉴定

化合物3为白色粉末，醋酐—浓硫酸反应呈阳性、Molish反应也为阳性，Ehrlich试剂显红色，表明该化合物为F-环开裂的甾体皂苷^[1]。ESI-MS确定分子量为902[m/z:903(M+H)⁺,925(M+Na)⁺].化合物3酸水解后，所得苷元TLC点板鉴定为萨尔萨皂苷元。m/z 741(M+H-162)⁺, 579(M+H-162×2)⁺， 417(M+H-162×3)⁺，说明该分子中存在三个六碳糖基。¹³CNMR谱中 δ 102.6, 106.1, 105.2为3个β 糖的端基信号，另外一个δ 103.6可推测为双键上的一个碳。化合物3水解后，仅检测出D-葡萄糖，说明化合物3中含三个葡萄糖。

将化合物3的与文献中知母皂苷C的¹³C-NMR进行对照，基本一致。说明化合物3即为知母皂苷C。

1.3.4化合物4的鉴定

化合物4呈白色粉末，醋酐—浓硫酸反应呈阳性，用于糖类和苷类检测的Molish反应也为为阳性，Ehrlich试剂显红色，表明该化合物为F-环开环的甾体皂苷。将化合物4酸水解，鉴定出皂苷元为菝契皂苷元，糖则检测出半乳糖以及葡萄糖^[2]。¹³C-NMR中，103.4, 105.2, 106.2是三个糖的端基碳信号，103.4与152.43信号证明了C-20与C-22位有双键。

将化合物4的与文献中知母皂苷D的¹³C-NMR进行对照，基本一致。说明化合物4即为知母皂苷D。

第二章 实验讨论

在本实验具体的提取分离实验过程中，难免会遇到一些问题，在克服问题的过程中，就产生了心得或谓之经验，总结如下：

2.1提取前溶剂的选择

在提取分离常用的溶剂中，水作为强极性的溶剂，可认为取之不尽、用之不竭，而且天然药物中的亲水成分都能被水溶出。水虽廉价易得，但也存在不少问题，如①水提取易酶解苷类成分，且易霉变；②某些含果胶与粘液质类的成分时，水提液很黏会堵滤纸孔，因此很难过滤；③水提液中含有皂苷及粘液质成分，在减压蒸馏浓缩时会产生很多泡沫，浓缩极度困难，一般可加少量戊醇或辛醇来克服。

除了水，像甲醇、乙醇、丙酮等这样亲水性有机溶剂，以乙醇最为常用，不仅溶解性好，对植物细胞的穿透性也很强。此外，乙醇毒性小，价格便宜加上来源也方便，所以成为常用溶剂。甲醇虽沸点较低但有毒故一般很少用。

本实验的知母中主含甾体皂苷类成分，极性较大，还含一些极性小的成分，而且多糖类成分也比较多，综合以上条件，选用75％的乙醇来进行提取。

2.2萃取过程中的问题

本实验中根据知母所含成分极性的大小，分两个段来萃取，所用溶剂为乙酸乙酯和正丁醇。一般萃取两相溶剂体积比大约为1:1，实验过程中先将所得浸膏用水溶解，然后用同等体积的乙酸乙酯来粹。实验中发现，用乙酸乙酯来萃取时出现厚的乳化层，通过以下办法来处理：①首先浸膏溶解的时候要充分，否则乳化层更多；②可以沿壁搅拌破乳；③可加过饱和氯化钠破乳；④长时间静置或离心破乳。正丁醇粹取的时候，乳化层较少。

2.3分离过程中的问题

在过硅胶柱时，在拌样时，要注意样品不含水，若样品和硅胶拌在一起长时间不干的话要再加点硅胶，将样品与硅胶充分混匀，当拌样成硅胶原来的细沙状时可上样，在上样前要平衡好柱子，加样品后要记得加适量的保护硅胶。之后冲硅胶柱时每个梯度一般要5-6个柱体积，而所用梯度则需要通过点板用不同比例的流动相来展开进行大量的条件摸索。

参考文献

[1] 马百平，董俊兴等，知母中呋甾皂苷的研究. 药学学报. 1996. 31 (4): 271-277

[2] 孟志云，徐绥绪. 知母中新的甾体皂苷. 沈阳药科大学学报. 1998. 15 (4): 235.