环介导等温扩增法检测结核分枝杆菌的应用

环介导等温扩增法检测结核分枝杆菌的应用

白建华

黑河市爱辉区农村疾病预防控制中心 黑龙江 黑河 164300

摘要：目的 探讨环介导等温扩增法（LAMP）检测结核分枝杆菌的应用价值。方法 选取我中心2019年1月到2020年1月期间临床诊断为肺结核的70例患者的痰标本，分别运用LAMP法与荧光染色法涂片法进行检测，分析检验结果。结果 70例标本中，LAMP法与荧光染色法涂片法的阳性检出率分别为45.71%（32/70）、28.57%（20/70），与荧光染色法涂片法对比，LAMP法的灵敏度为95%（19/20）、特异度为76%（38/50），总体一致率为81.43%（57/70）。两种方法一致性对比差异具有统计学意义（P<0.05），两者一致性良好。在检测时间上，与涂片法相比，大批量标本检测中LAMP法所用时间较短。结论 痰标本检测中，LAMP法阳性检出率优于荧光染色法涂片法，批量检测性好，具有较好的临床应用前景。

关键词：结核分枝杆菌；LAMP法；检测

Application of ring - mediated isothermal amplification in detection of Mycobacterium tuberculosis

Abstract: Objective To investigate the application value of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in detection of Mycobacterium tuberculosis.Methods The sputum specimens of 70 patients clinically diagnosed with tuberculosis in our center from January 2019 to January 2020 were selected for detection by LAMP method and fluorescent staining smear method respectively, and the test results were analyzed.Results The positive detection rates of LAMP and fluorescent smear were 45.71% (32/70) and 28.57% (20/70), respectively. Compared with fluorescent smear, LAMP showed a sensitivity of 95% (19/20) and specificity of 76% (38/50), and an overall consistency rate of 81.43% (57/70).The consistency of the two methods was compared and the difference was statistically significant (P<0.05), the two have good consistency.In terms of detection time, COMPARED with smear method, LAMP method used in mass specimen detection was shorter.Conclusion The positive detection rate of LAMP is better than that of fluorescent smear in sputum specimen detection, with good batch detection performance and good clinical application prospect.

Key words: Mycobacterium tuberculosis;LAMP method;detection

引言

在我国2010年全国第5次结核病流行病学调查结果显示，结核病负担严重，如何高效的防治结核病成为急需解决的重要问题之一^[1]。目前结核病的诊断技术对于日益提高的临床需求来说，具有相对的落后性，开发更加适于临床需要的结核病诊断技术及产品是急需解决的问题，也是结核病防治的重要环节及迫切需要。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新型核酸检测技术，与传统的核酸扩增技术相比，其只需恒定温度就能进行扩增反应。本文将具有操作简单且快速特点的LAMP技术应用于肺结核病患者中，检测其结核分枝杆菌，并通过与目前常规诊断方法荧光染色涂片法进行对比，以此来分析LAMP技术在检测结核分枝杆菌的时效性，评估该技术是否适于结核病诊断的常规临床应用。

1.资料与方法

1.1一般资料

选取我中心2019年1月到2020年1月期间临床诊断为肺结核的70例患者的痰标本，分别运用LAMP法与荧光染色法涂片法进行检测，分析检验结果。

1.2仪器与试剂

LAMP法试剂盒及恒温扩增仪，显微镜，荧光染色法液，阴阳性质控液：人工合成基因序列片段与去离子水。

1.3方法

将79例肺结核患者送检合格痰标本进行LAMP法与荧光染色法涂片法进行检测。

荧光染色涂片法：采用荧光染色法对痰标本进行涂片染色，具体步骤严格按照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求进行操作。镜检报告标准：抗酸杆菌阴性（—）：连续观察50个视野，未发现抗酸杆菌；抗酸杆菌阳性：1-9条抗酸杆菌/50视野；抗酸杆菌阳性（1+）：10-49条抗酸杆菌/50视野；抗酸杆菌阳性（2+）：1-9条抗酸杆菌/每视野；抗酸杆菌阳性（3+）：10-99条抗酸杆菌/每视野；抗酸杆菌阳性（4+）：100条以上抗酸杆菌/每视野。

LAMP技术：将痰盒，加热管（样本数加1个阴性对照），阴性对照，加热管架，移液器和枪头放置在生物安全柜中。使用移液器将60ul痰液和阴性对照从痰盒转移至加热管。翻转加热管3次，将加热管放入加热模块内，90℃加热5分钟。从包装中取出与加热管等量的吸附管，放置在吸附管架上面。将加热管底部用力旋入吸附管顶端，并拧紧。将吸附管垂直用力震动10次，水平用力甩动10次，充分混合后液体为乳白色或浅黄色。倒置吸附管，使注射帽侧翼与吸附管侧翼对齐，将注射帽推入吸附管，旋转固定。取下帽环将纯化装置的尖端垂直放入反应管内，开始加样，样本量在反应管双刻度之间，盖好反应管的盖子。所有样本加入完成后加入阳性对照，再将全部反应管编号倒置2分钟 ，2分钟后上下翻转5次翻入相应的反应模块中67℃反应40分钟。

结果判定：打开荧光开关，观察样品是否与阳性对照一样有荧光显示，如果有样品有荧光显示则判断为阳性，表明含有结核分枝杆菌，否则判断为阴性，不含有结核分枝杆菌。

1.4统计学方法

采用SPSS20.0进行统计分析，方法间配对计数资料的比较采用McNemar检验和Kappa一致性检验。对计量资料采用百分比描述。方法间率的比较采用χ²检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

两种方法阳性检出率对比，，LAMP法与荧光染色法涂片法的阳性检出率分别为45.71%（32/70）、28.57%（20/70），如表1。与荧光染色法涂片法对比，LAMP法的灵敏度为95%（19/20）、特异度为76%（38/50），总体一致率为81.43%（57/70）。一致性分析：：Kappa≤0.4，一致性程度弱；0.4＜Kappa≤0.6，一致性程度适中；0.6＜Kappa≤0.8，一致性程度良好；0.8＜Kappa≤1.0，一致性程度最佳。检测结果统计分析显示：两方法的一致性分析中，Kappa＝0.641，介于0.6＜Kappa≤0.8，两者一致性良好。McNemar检验分析，两方法阳性检出率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

3.讨论

现有的结核病诊断技术包含有细菌学诊断、免疫学诊断及临床影像学诊断等，免疫血清学检测虽具有快速、操作简单等优点，但目前未发现具有确诊效能的标志物，因此结核病的实验室检查主要依赖于细菌学诊断^[2]。LAMP技术是一种快速诊断技术，其以核酸扩增技术为基础，在67℃等温条件下使用高效的DNA聚合酶进行反应，全过程约1h。该技术与传统的PCR技术相比，其无需专用的PCR实验室场地，无需昂贵的核酸扩增仪和检测设备，其要求的基础投入少，相较于基层结核病诊疗机构相对落后的设施环境以及较少的医疗投入而言，该方法更为适用于基层诊疗机构的临床应用^[3]。

本次研究显示，LAMP技术检测结核分枝杆菌阳性检出率较高，灵敏度为95%，特异度为76%，且其与荧光染色法涂片法的一致性良好。

综上所述，痰标本检测中，LAMP法阳性检出率优于荧光染色法涂片法，批量检测性好，具有较好的临床应用前景。

参考文献

[1]王鸿,刘权贤,陈玲,李瑜琴,袁阳,张建勇.LAMP法在临床诊断的肺结核患者BALF标本中的应用评价[J].国际检验医学杂志,2019,40(07):783-786.

[2]孙艳杰.环介导等温扩增法对痰标本中结核分枝杆菌检测效果的评估[J].世界最新医学信息文摘,2018,18(39):131+133.

[3]戴婷婷,陆辰晨,郑小波.环介导等温扩增技术在病原物检测上的应用研究进展[J].南京农业大学学报,2015,38(05):695-703.