异甘草酸镁对内质网应激诱导小鼠肝损伤的保护作用1

马晓磊 1，吴恒 1，李晓明 2，王兆斌 1，赵同清 1

1蚌埠市第三人民医院药学部，蚌埠 233000

2蚌埠市医学院药学系，蚌埠 233000

摘要 目的 研究异甘草酸镁对内质网应激诱导小鼠肝损伤的保护作用，为临床患者使用提供依据。 方法 腹腔注射给予异甘草酸镁进行肝脏预保护，单次体内灌胃衣霉素（1mg/kg）建立小鼠内质网应激性急性肝损伤模型。取组织称重，计算肝脏、脾脏及胸腺等脏器指数；ELISA法检测血清中谷丙氨酸转换酶、谷草氨基酸转换酶及肝匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛和超氧化物歧化酶含量；HE染色观察肝组织病理改变；免疫组化法检测肝组织中GRP78/Bip蛋白表达水平。 结果 异甘草酸镁能减少肝脏肿大及肝脏组织炎性细胞浸润，改善病变范围与程度；降低肝损伤小鼠血清中谷丙氨酸转换酶、谷草氨基酸转换酶水平及肝组织匀浆中丙二醛含量，提高肝组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶含量；抑制肝组织中GRP78/Bip蛋白的表达。 结论 异甘草酸镁可能是通过抗氧化作用保护内质网应激诱导的小鼠急性肝损伤。

关键词 异甘草酸镁；内质网应激；肝损伤；保护作用

内质网（endoplasmic reticulum,ER)作为细胞内最大的功能细胞器，主要参与合成脂质、蛋白质和调节细胞钙离子平衡^[1]。当发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS)时，会导致肝病、糖尿病、神经退行性疾病，心血管系列疾病等，最新研究表明ERS还能够增强T细胞介导的免疫抑制反应^[2]。甘草酸系甘草中提取的三萜皂苷类物质，能够增强肝脏解毒能力，抑制肝细胞炎症反应。异甘草酸镁（magnesium isoglycyrrhizinate, MgIG）作为第四代甘草酸类制剂，具有类似非特异性抗炎作用且无抑制免疫功能的不良反应而广泛用于治疗多种肝脏疾病^[3]。本研究使用衣霉素( tunicamycin，TM)诱导小鼠ERS肝损伤模型,研究肝损伤指标的变化并探讨MgIG的保护作用。

1 材料与方法

1. 1. 实验材料及试剂

动物：昆明种雄鼠60只，体重18~20 g，8~10周龄。

试剂及药品：TM、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、免疫组化S-P试剂盒、DAB显色试剂盒、GRP78抗体、异甘草酸镁注射液、联苯双酯。

1.2 动物模型制备及给药方案 60只小鼠随机分为6组，每组10只，设立正常组、MgIG（15、30、45 mg/kg）组、TM模型组、联苯双酯（150 mg/kg）组。用药方案：MgIG组给予三种剂量的MgIG腹腔注射，联苯双酯组给予联苯双酯腹腔注射，qd*12 d。末次腹腔注射2 h后，除正常组外，其余各组分别灌胃给予TM（1mg/kg）。禁食16 h后处死老鼠，眼球摘除取血分离血清，剖杀后取肝脏、脾脏、胸腺组织，置于-80 ℃保存备用，一部分肝脏置于10％甲醛固定，用于HE和免疫组化。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 生化指标检测 取小鼠血清和肝组织匀浆，测定ALT、AST活性及肝脏中GSH-Px、MDA、SOD含量。

1.3.2 病理组织学检查 取部分肝组织10％甲醛固定，石蜡包埋，4 µm切片，经HE染色，采用光学显微镜观察组织病理变化。

1.3.3 免疫组化染色检测肝组织GRP78/Bip 取部分肝组织10％甲醛固定，石蜡包埋4 µm切片，使用的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法观察蛋白表达的变化。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以 ±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 MgIG对ERS肝损伤小鼠肝、脾、胸腺指数的影响

对比正常组，模型组小鼠肝脏指数明显升高（P<0.01），MgIG（15、30、45 mg/kg）组能降低肝脏指数，与模型组有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。对比正常组，模型组小鼠脾脏、胸腺指数略升高， MgIG（15、30、45 mg/kg）组对比模型组略有降低，均无统计学差异，见表1。

表1 MgIG对ERS肝损伤小鼠的肝、脾、胸腺指数的影响（ ±s,n=10）

^﹟﹟P<0.01与对照组比较；^﹡P<0.05，^﹡﹡P<0.01与模型组比较

2.2 MgIG对ERS肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响

对比正常组，模型组小鼠血清中ALT、AST值明显升高（P<0.01）。MgIG（30、45 mg/kg）组能降低ALT水平，与模型组有显著性差异（P<0.05，P<0.01）， MgIG（15、30、45 mg/kg）组能降低AST水平，与模型组有显著性差异（P<0.05，P<0.01），见表2。

表2 MgIG对ERS肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响（ ±s,n=10）

^﹟﹟P<0.01与对照组比较；^﹡P<0.05，^﹡﹡P<0.01与模型组比较

2.3 MgIG对ERS肝损伤的小鼠肝匀浆中GSH、MDA、SOD的影响

对比正常组，模型组小鼠肝匀浆中MDA值显著提高， GSH-Px、SOD值显著降低（P<0.01）。MgIG（30、45 mg/kg）组能降低MDA水平（P<0.05，P<0.01）、提高GSH-Px水平（P<0.01），MgIG（15、30、45 mg/kg）组能提高SOD水平（P<0.05，P<0.01），见表3。

表3 MgIG对ERS肝损伤小鼠肝匀浆GSH-Px、MDA、SOD水平的影响（ ±s,n=10）

^﹟﹟P<0.01与对照组比较；

^﹡P<0.05，^﹡﹡P<0.01与模型组比较

2.4 MgIG对ERS肝损伤小鼠的病理组织学的影响

图1可见，正常肝细胞排列整齐，大小正常，模型组出现了明显病变，大多数肝细胞肿胀，排列紊乱，出现炎症细胞浸润及空泡状样变。MgIG组可减轻肝细胞病变范围与程度，大剂量组趋于正常肝脏形态。

图1 MgIG对ERS肝损伤小鼠肝脏病理组织学的影响

A：正常组； B：模型组； C：MgIG15 mg/kg； D：MgIG30 mg/kg； E：MgIG45 mg/kg； F：联苯双酯150 mg/kg

2.5 MgIG对ERS肝损伤小鼠的肝组织中GRP78/Bip蛋白表达的影响

图2可见，正常组肝脏胞浆内未出现棕褐色阳性细胞，模型组中出现大量棕褐色阳性细胞，表现出强阳性的蛋白表达。MgIG组阳性细胞变少，且随剂量增加阳性细胞数逐渐减少。

图2 MgIG对ERS肝损伤小鼠的肝组织中GRP78/Bip蛋白表达的影响

A：正常组； B：模型组； C：MgIG15 mg/kg； D：MgIG30 mg/kg； E：MgIG45 mg/kg； F：联苯双酯150 mg/kg

3 讨论

TM是天然的核苷抗生素，通过抑制蛋白质糖基化修饰诱导ERS介导细胞凋亡^[4]。TM被报道^[5]诱导多种细胞的体外模型，亦有报道^[6]使用TM体内灌胃给药诱导肝脏损伤、肝细胞凋亡的研究。本研究结果显示，模型组小鼠肝小叶内可见肝细胞肿胀，排列紊乱，出现炎性浸润，小鼠的肝指数明显增大，血清中ALT和AST水平明显升高，作为ERS标志性蛋白GRP78/Bip的蛋白水平明显升高，显示TM灌胃给药成功诱导了小鼠ERS肝损伤。ERS导致的炎症反应可能会导致脾脏、胸腺指数的升高，在本研究中并未有明显的变化，其原因可能与造模后处死小鼠的时间相关。段冷昕^[7]等使用CCL₄诱导急性肝损伤后在不同时段处死小鼠，测定脾脏指数会产生不同的变化。

对比模型组，MgIG组明显减轻肝脏炎症细胞浸润和坏死，显著降低肝脏指数，降低肝损伤小鼠血清中ALT和AST水平，且具有一定的剂量相关性。联苯双酯是公认的降酶药，由于不能改善慢性肝炎的病理，无抑制病毒复制的作用，且具有停药反跳率高、加重肝损伤^[8]等不良反应现已很少用于临床。MgIG在本研究中表现出的肝脏保护作用提示在临床中可以作为ERS导致的肝损伤患者一线用药。

氧化指标结果显示，模型组肝匀浆中MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显降低，提示TM诱导的ERS产生了氧化损伤。MgIG能显著降低肝匀浆中MDA水平，提高SOD、GSH水平。MgIG的抗氧化损伤机制^[9]可能为通过减轻线粒体损伤及降低活性氧的释放从而抑制游离脂肪酸导致的损伤。本研究结果提示MgIG对ERS肝损伤的保护作用可能与抑制肝脏内的氧化应激及脂质过氧化有关。

参考文献

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基金项目：蚌埠医学院科研项目（编号：BYKY16151）

蚌埠市科技局计划项目（编号：20160326）

作者简介：马晓磊，男，主管药师，硕士研究生；

作者单位：¹蚌埠市第三人民医院药学部，蚌埠 233000

²蚌埠市医学院药学系，蚌埠 233000

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