基于脐疗法的热敏灸贴膏剂对寒凝证痛经模型大鼠的作用机理研究

基于脐疗法的热敏灸贴膏剂对寒凝证痛经模型大鼠的作用机理研究

胡律江 1 ，彭亮 2 ，赵晓娟 1 通讯作者

1 江西中医药大学附属医院，江西南昌， 330006 ; 2 樟树市人民医院，江西宜春， 331200

【摘要】目的：探讨基于脐疗法的热敏灸贴膏剂对寒凝证痛经模型大鼠的作用机理研究。方法：按随机抽签法将大鼠分为空白组、寒凝证痛经模型组与研究组，每组20只大鼠；除空白组外，均采用全身冷冻法造成大鼠寒凝证并结合痛经模型的制备方法，建立寒凝证痛经大鼠模型。通过观察大鼠T细胞亚群CD3、CD4、CD8水平、血清中SP及前列腺素（PGF2α）含量及扭体次数变化，判断基于脐疗法的热敏灸贴膏剂的镇痛效果及作用机理。结果：模型组的CD3、CD4、CD8有明显改变，数据差异具有统计学意义；使用四制香附热敏灸贴膏剂后，大鼠的CD3及CD4均有所上升，CD8较模型组略微下降；与模型组对比，研究组的SP含量有明显上升，接近于正常值水平，前列腺素也明显下降；扭体反应下降明显，数据均有统计学意义P<0.05。结论：基于脐疗法的热敏灸贴膏剂可有效改善大鼠的疼痛症状，并调节大鼠血清中的SP及PGF_2α水平减少了大鼠的子宫收缩，具有较好的镇痛作用；可为临床使用提供数据支持。

【关键词】脐疗法；热敏灸；贴膏剂；寒凝证痛经模型

痛经是妇科临床常见疾病，现代医学难以攻克难题之一。在年轻妇女中患病率高达20%～90%，严重者占15%^[1]，且患病率呈明显上升趋势，影响患者正常的工作和学习。中医认为痛经的病位在胞宫，寒性收引、凝滞，导致经络不通，气血淤滞胞宫，胞宫失养导致痛经。在对痛经的中医辨证分型中发现，寒凝证痛经在各种证型中所占比例最高，临床最为常见。热敏灸是中医治疗痛经的有效方式之一，尤其是在治疗寒湿凝滞证方面最为多见；故采用脐疗法的热敏灸贴膏剂对大鼠寒凝证痛经模型进行治疗，探讨分析此治疗方案的作用机理，现研究分析如下。

1 材料

1.1 动物 处于动情间期的SD大鼠60只（来自湖南斯莱克景达实验动物有限公司）。饲养条件：保持室内温度在22~24 ℃，湿度(45±5)%，日光灯光照，大鼠食用普通清洁级大鼠饲料，自来水可自由饮用。

1.2 仪器设备与试剂 BC /BD-379HB卧式冰柜（青岛海尔集团）；荧光定量PCR仪（美国应用生物公司）；P6 40型红外热像仪（美国FLIR公司）；建昌帮四制香附；苯甲酸雌二醇（上海通用药业，批准文号：国药准字H31021114）；缩宫素（天津市生物化学制药厂，批准文号：国药准字H12020487）

2 方法

2.1 模型建立：遵循中医证候模型的造模思路及特点，拟采用寒凝证模型结合痛经模型的造模方法。先采用全身冷冻法造成大鼠寒凝证，并通过寒凝证模型结合痛经模型的制备方法，建立寒凝证痛经大鼠模型。

首先通过阴道涂片，确定大鼠动情周期阶段，选取处于动情间期的大鼠，制备痛经大鼠模型。采用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇注射法造模，每日给予大鼠腹部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液，连续10d，第1d及第10d日注射0.5 mg /只，第2-9d每日0.2 mg /只，末次给药后1 h，腹腔注射缩宫素2 U /只，第1-5d每日在给药后放入-25 ℃冰柜冷冻4 h，中途在2 h 打开冰柜换气5s。

2.2治疗方法：空白组与寒凝证痛经模型组不予以任何治疗，其余操作均与研究组相同；研究组使用四制香附热敏灸贴膏剂，将大鼠神阙穴周围的毛发剔除后，用75%的酒精消毒，之后将贴膏剂贴于神阙穴，连续治疗两周。

2.3 四制香附热敏灸贴膏剂制备：将活性炭-还原铁粉-氯化钠-水按10 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 2的比例制备辅助发热材料，并通过预实验的处方筛选制备优选贴膏剂基质（NP700-羧甲基纤

维素钠-卡波姆934-结晶氯化铝-乙二胺四乙酸二钠-酒石酸-硅藻土比例：82 ∶ 92 ∶ 9 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 5 ∶ 156）按2015版《中国药典》方法进行制备与质量控制。最后将发热材料附上凝胶贴膏剂并于背面附上医用压敏胶贴，以固定于皮肤。

2.3 观察指标

考察热敏灸贴膏剂脐疗法对寒凝证痛经模型大鼠神阙穴周围温度、T细胞亚群CD3、CD4、CD8水平、血清中SP及前列腺素（PGF_2α）含量及相关内分泌相关分子受体基因的影响及扭体次数变化。取大鼠尾部血液，采用免疫荧光法对T细胞亚群进行检测；采用ELISA法测量大鼠血清中的前列腺素含量，并使用放射免疫法测量血清中的SP；采用荧光定量PCR测定相关内分泌相关分子受体基因。

2.4 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件对采集的数据进行分析，计数资料以百分数（%）表示和计量资料（ ）表示，组间资料比较使用t检验。

3结果

3.1 T细胞亚群CD3、CD4

、CD8水平 从表中数据分析，模型组的CD3、CD4、CD8有明显改变，数据差异具有统计学意义；使用四制香附热敏灸贴膏剂后，大鼠的CD3及CD4均有所上升，CD8较模型组略微下降。见表1。

表1 T细胞亚群CD3、CD4、CD8水平

注：与空白组相比，P<0.01，差距显著；与模型组比较，P<0.05差异明显。

3.2 血清中SP及前列腺素（PGF_2α）含量 由表2数据可知，与空白组相比，模型组的SP含量下降显著，前列腺素含量显著升高；与模型组对比，研究组的SP含量有明显上升，接近于正常值水平，前列腺素也明显下降，数据差异显著P<0.05。

表2血清中SP及前列腺素（PGF_2α）含量

注：与空白组相比，P<0.01; 与模型组比较，P<0.05

3.3大鼠的扭体反应

表3 大鼠的扭体反应比较

注：与空白组相比，P<0.01，差距显著；与模型组比较，P<0.05差异明显。

4 讨论

以脐疗为代表的外治法在治疗痛经上具有给药途径特殊、疗效确切、安全可靠的优势。脐疗是指将药物做成适当剂型（如糊、散、膏等）敷于脐（神阙穴）部（或在脐部给以某些物理刺激（如艾灸、针刺、热熨等）以治疗疾病的方法^[2]。脐疗通过直接或间接调控胞宫的寒热虚实达到调整全身气机及冲任气血，治疗痛经的作用。近年来，穴位贴敷、艾灸、脐疗等中医外治法治疗痛经的临床应用逐渐增多，但治疗机理和新制剂研究较少。

通过制作小鼠痛经模型，以四制香附热敏灸贴膏剂为治疗药物，研究药物治疗痛经的作用机制。研究结果发现此贴膏剂的最高温度为44~46℃，使神阙穴周围的维持较适宜的温度，有助于寒凝证大鼠神阙穴处的气机畅通；中医认为“不通则痛，通则不痛”。因此使用热敏灸贴膏剂后大鼠的扭体反应次数相较于模型组明显减少。数据结果显示，使用热敏灸贴膏剂后，大鼠体内的T细胞亚群CD3，CD4含量明显上升，CD8含量略微减少差异不大；有文献资料表示^[3]：使用灸法治疗原发性痛经可使患者机体内的CD3、CD4含量增加，以促进T细胞的增殖分化，本研究结果与其相似，但CD8含量变化不大，因此对T细胞的抑制和杀伤作用小，副作用小；前列腺素对原发性痛经有重要影响， 从研究结果分析，寒凝证痛经模型大鼠体内的前列腺素含量显著增加，疼痛反应明显；使用贴膏剂治疗后，前列腺素含量有明显下降，虽不及空白组，但镇痛效果明显，数据差异P<0.05。

以上分析结果表明，四制香附热敏灸贴剂可影响大鼠体内的神经系统内分泌物质前列腺素的含量，以减轻大鼠痛经模型的疼痛现象^[4]，从扭体反应的潜伏期、扭体次数可知。同时前列腺素还可影响机体的免疫系统，抑制机体的辅助T细胞，以减少对机体T细胞的影响。

综上所述：热敏灸贴膏剂的镇痛效果明显，可从多方面抑制引发原发性痛经的内在因素，对痛经大鼠的疗效显著，可用于临床数据推广，为热敏灸贴膏剂的临床使用增加证据。

参考文献：

[1]伍梅芳.五年制高职女生原发性痛经相关影响因素与灸脐疗法相关性研究[J].中医药导报,2017,23(10):94-96.

[2]郭慧玲,骆云霞,胡律江,赵晓娟,胡志方,董能峰,胡强.四制香附贴膏灸剂在大鼠体内的血液流变性与体外透皮特性分析[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(11):29-33.

[3]李姝婧,马玉宁,陈辰,潘亚辉,马玉侠.艾灸对寒凝血瘀型痛经大鼠子宫瞬时受体电位香草酸亚型1表达的影响[J].中华中医药学刊,2020,38(01):41-44+260.

[4]王丹丹,王东梅,蔡平平,孟迎迎,翟凤婷.温经化瘀止痛法治疗原发性痛经的临床疗效及其对T细胞亚群的调控机制[J/OL].中国实验方剂学杂志:1-6[2020-09-04].https://doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20201963.

基金项目：江西省卫计委中医药科研项目，2018A334