阿奇霉素片中大肠埃希菌的检测

阿奇霉素片中 大肠埃希菌的 检测

黄娟 * ，刘桂香

重庆科瑞制药（集团）有限公司 重庆 400060

摘要：目的：建立阿奇霉素片中控制菌（大肠埃希菌）质量控制方法。方法：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，置无菌条件低速（500转/分）离心5分钟，取上清液10ml，用薄膜过滤法过滤，pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液400ml冲洗滤膜四次，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，在最后一次的冲洗液中接入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，过滤后取出滤膜接入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时，同时做阳性对照试验、供试品对照组和阴性对照试验。结果：控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基及检测方法的适用性符合要求，加菌试验组和阳性对照组均能有效检出大肠埃希菌，供试品对照组和阴性对照均未检出。结论：该检测方法可行，能有效控制产品的大肠埃希菌。

关键词：阿奇霉素；薄膜过滤法；大肠埃希菌。

阿奇霉素(azithmmyein)是氮杂内酯类抗生素，对革兰氏阳性球菌具有强抗菌活性，对于革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、产气肠杆菌、枸橼酸杆菌及消化链球菌等有抗菌作用，对化脓性链球菌及肺炎球菌表现出较强的杀菌作用，此外，阿奇霉素对支原体、衣原体亦有抗菌作用。阿奇霉素具有抗菌谱广、抗菌力强的特性，是一种治疗院外获得性呼吸系统及泌尿生殖系统感染的有效药物^[1]。由于阿奇霉素有抑菌性，因此在微生物控制菌检测中，必须采用一定的手段去除配制检测液中的阿奇霉素，以防止对大肠埃希菌的抑菌性，达到检测控制菌的目的，现报道如下：

1 仪器与试药

CSH-222J-生化培养箱（重庆创测科技有限公司），LDZX-75KBS-立式压力蒸汽灭菌器（上海申安科学仪器有限公司）；枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26 003、铜绿假单胞菌CMCC（B）10 104、白色念珠菌CMCC (F) 98 001、 黑曲霉CMCC(F)98 003、大肠埃希氏菌标准菌株CMCC(B)44103均来自中国药品生物制品检定研究院；沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯琼脂培养基、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液均来自北京路桥技术有限公司；阿奇霉素片（国药准字H20058149，规格：0.25g，批号：200101、200102、200103，重庆科瑞制药（集团）有限公司）。

2 方法与结果

2.1控制菌（大肠埃希菌）的检查菌液的制备：取新鲜的大肠埃希菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，经30～35℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml不大于100cfu的菌悬液。

2.2 大肠埃希菌检查用培养基的适用性检查

（1）促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，与对照培养基管比较，结果：被检培养基试验菌应生长良好。

（2）抑制能力检查：接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～24小时，结果：与对照培养基管比较，试验菌应不得生长。

（3）指示特性检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的大肠埃希菌于麦康凯琼脂培养基和对照培养基平板上，在30～35℃培养18～24小时，结果：被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基一致。

2.3大肠埃希菌检查方法适用性试验

（1）加菌试验组：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液，置无菌条件低速（500转/分）离心5分钟，取上清液10ml，用薄膜过滤法过滤，pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液400ml冲洗滤膜四次，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，在最后一次的冲洗液中接入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml，过滤后取出滤膜接入100ml胰酪大豆液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

（2）阳性对照试验：取不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液1ml加入pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100ml中过滤后，取出滤膜接入100ml胰酪大豆液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。

（3）供试品对照组：取1：10供试液10ml过滤，置无菌条件低速（500转/分）离心5分钟，取上清液10ml，用薄膜过滤法过滤，pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液400ml冲洗滤膜四次，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，过滤后取出滤膜接入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

（4）阴性对照试验：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，过滤后取出滤膜接入100ml胰酪大豆液体培养基中，混匀，于30～35℃培养18～24小时。

（5）选择和分离培养：分别取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72小时。

（6）结果判断：若上述试验组检出试验菌，按此供液试液制备方法和大肠埃希菌检查进行供试品的控制菌检查，阳性对照试验组应有菌生长，阴性对照试验组应无菌生长，若未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌性，并重新进行方法适用性试验。分别进行3次独立的平行试验。结果：大肠埃希菌检查方法的验证结果显示加菌实验组和阳性对照组控制菌均生长良好，供试品对照组和阴性对照组均未检出。

2.5阿奇霉素片大肠埃希菌的检测

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液，置无菌条件低速（500转/分）离心5分钟，取上清液10ml，用薄膜过滤法过滤，pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液400ml冲洗滤膜四次，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml，过滤后取出滤膜置于100ml胰酷大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。分别取上述培养物1ml，接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养18～72小时。若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离，纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌，若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。对连续生产的自制品（批号：200101、200102、200103）中试样品进行检查，检测结果见表1。

表1 数批样品微生物限度检查结果

讨论：在检测过程中，均按照《中国药典》2015年版四部薄膜过滤法进行试验，其方法的判断结果准确，我公司连续3批生产样品均未检出大肠埃希菌，说明车间质控严格，未带入致病菌，产品质量可靠。

参考文献

[1] 辛桂杰,杨秀云,王峰,等.阿奇霉素片的相对生物利用度和生物等效性.吉林医学.2007,28（1）：37-38

*通讯作者：执业药师，高级技师，质量主管,研究方向：微生物控制研究，电话：15922756568,邮箱：2929685399@qq.com