布比卡因脂质体粒度分析方法的研究

布比卡因脂质体粒度分析方法的研究

贺周扬 1*，王琴 1，李闫飞 1

（ 1.广东嘉博制药有限公司，广东 清远 511500）

摘要 目的 建立测定布比卡因脂质体的粒度及其分布方法。方法 采用Mastersizer 2000激光粒度分析仪，通过改变测量过程中的遮光度、泵速、循环时间、超声强度及分散介质等参数，比较不同测量参数下对粒径的影响。结果 测量条件的变化会对产品粒径结果产生一定的影响，因此在测量时应当合理地选择测量参数。本产品在测量过程中的遮光度不能高于30%，适宜的泵速范围是1000～2000r/min，测试样品的循环时间为30s，选用纯化水作为分散介质，不需要使用超声进行分散。结论 该方法简便、准确、重复性好，适用于布比卡因脂质体的粒度测定。

关键词：布比卡因脂质体；激光粒度仪；粒度分析

中图分类号：R927.1 文献标志码：A

Research on the Method of Particle Size Distribution Analysis about Bupivacaine Liposomes

HE Zhouyang¹, WANG Qin¹, LI Yanfei¹

(1. Guangdong Jiabo Pharmaceutical Co. Ltd, Guangdong Qingyuan,511500, China)

ABSTRACT Objective: To establish a method for the determination of particle size and distribution for bupivacaine liposomes. MEATHODS: Mastersizer 2000 laser particle size analyzer was used to compare the influence of different measurement conditions on particle size by changing the parameters such as obscuration, pump speed, cycle time, ultrasonic intensity and dispersion medium. RESULT: The results showed that the various measurement conditions have a certain impact on the particle size distribution，so the measurement parameters should be selected reasonably．The conditions of determination were drawn as follows: the obscuration should be less than 30%，the pumping speed should be between 1000～2000r/min，the test sample cycle time of 30s，using pure water as a dispersion medium and the ultrasonic need not be used．CONCLUSION: The method is accurate, simple and repeatable, and suitable for the particle size analysis of bupivacaine liposomes.

Key words: bupivacaine liposomes; laser particle size analyzer; particle size distribution analysis

盐酸布比卡因（bupivacaine hydrochloride，BUP）是临床上常用的局部麻醉药，普通注射液由于半衰期较短，需要多次给药，患者术后镇痛顺应性差，通过将其制备成长效局麻药，从而有效延长了镇痛时间，减少了全身毒性的发生，并且可以提高布比卡因的给药剂量^[1-3]

脂质体（liposomes）是由一层或多层双分子磷脂膜包裹水相所组成的微型球状物，可以是单室、多室或多囊结构。其中多囊脂质体（multivesicular liposomes，MVL）是以贮库泡沫技术为基础的新型脂质体，内部由多个水性腔室以非同心圆的形式紧密填充而成，各水性腔室之间以脂质双分子层相隔，粒径1-100μm，具有较大的包封容积。当某个囊泡破裂时，药物只从破裂的囊泡释放，只有当最外层的膜破裂，才会使包封的药物释放到外部介质中，这种独特的结构使其具有良好的缓释效应

^[4]。目前国外上市的布比卡因脂质体使用Depo Foam技术制备，每一个微粒都是由多个封存了布比卡因的水性腔室及隔离腔室的脂质双分子层组成^[5-6]。

Mastersizer 2000激光粒度仪采用小角度激光衍射技术进行粒径测定。其原理是基于激光通过颗粒时发生衍射，其衍射角度与颗粒粒径相关，不同粒径的颗粒所衍射的光会落在检测器的不同位置，从而反映出颗粒的粒径大小。这种型号的激光粒度仪具有动态范围宽、测量迅速、数据重现度高、可以直接获得粒径的体积分布等优点^[7]。

本研究通过对制备的布比卡因脂质体进行粒度考察，建立了操作简便、准确、快速的粒径测定方法。

1.材料与仪器

1.1试验材料

布比卡因（济南诚汇双达化工有限公司16121304），大豆磷脂（广州汉方制药，M160202），二棕榈酰磷脂酰甘油(Lipoid，560300-2150040-01)，胆固醇（广州汉方制药，L1160010），三辛酸甘油脂（Sigma，BCBJ7208V），葡萄糖（西王药业，201401302），赖氨酸（阿拉丁试剂，L1403021），氯化钠（台山制药，20150502），二氯甲烷（广州化学试剂厂，20160302）

1.2仪器设备

乳化分散机（T25，IKA公司），马尔文激光粒度仪（Mastersizer2000，马尔文仪器有限公司），光学显微镜（MD50，广州明美科技有限公司）

2.实验方法

将50g/L的布比卡因溶液5ml加至等体积含有大豆磷脂100mg，二棕榈酰磷脂酰甘油 25mg，胆固醇150mg和三辛酸甘油脂20mg的二氯甲烷中，10000rpm高速剪切5min制备W/O型初乳。吸取以上初乳1mL加入含有5％葡萄糖注射液5mL和40 mmol/L赖氨酸游离碱的混合溶液（外水相）中，4000rpm剪切20s形成W/O/W型复乳。将此复乳快速转移至含有25mL外水相的控温30 ℃水浴的锥形瓶中，磁力搅拌并在液面持续通入氮气（流量为6 L/min）10min，用生理盐水稀释后即得布比卡因脂质体混悬液。

将布比卡因脂质体混悬液用马尔文激光粒度仪进行粒径分析。所有样品测试前先在进样系统中循环一定时间，以保证测试样品与分散溶剂混合均匀。

3.实验结果和讨论

3.1显微镜图片

如图1所示，布比卡因脂质体的显微图片显示粒径范围在24-34μm之间，粒径分布较窄，外形接近球形颗粒。因此，选用中值粒径( D50) 能够较好地反映颗粒的大小及分布情况。

图1 布比卡因脂质体的光学显微镜片（x400）

Fig.1 The micrographs of bupivacaine liposomes(x400)

3.2遮光度的影响

遮光度的大小直接反映了测量样品的质量多少，它随着样品质量的增大而逐渐增大，测量样品粒子的大小和质量不同，产生的散射光强也会有所不同；因此，样品量是影响测量结果的直接因素。

滴加样品到分散介质中，循环泵将样品均匀分散并使其进入检测光路中。激光粒度仪通过遮光度的大小确定样品的加入量是否合适，遮光度过大或过小都将影响测量的精确度^[8]。

固定泵速为1500r/min，考察遮光度参数对产品粒径分布的影响，结果下图所示。由图2、图3可知，遮光度在5%-20%的范围内粒径分布曲线形状变化不明显，遮光度变化对样品的粒径分布影响不大。当遮光度超过30%以后，随着遮光度的增加，粒径D50有逐渐变小的趋势，残差显著增大，直至遮光度50%时残差大于3%。残差是激光粒径仪特有的参数，既能反应样品的分布情况是否合适，也能反应样品的光学参数（折射率、吸收率）是否正确，通常来说要求残差数值小于3%。

图2 不同遮光度下布比卡因脂质体的粒径分布

Fig.2 Particle size distribution of bupivacaine liposomes under different obscuration

图3 不同遮光度下布比卡因脂质体的D50和残差变化

Fig.3 D50 and residual changes of bupivacaine liposomes under different obscuration

数据的残差过大可能是因为当遮光度过高时，分散介质中颗粒的浓度很高，大量的颗粒使激光发生多次衍射及散射，从而对分析结果的精确性造成影响。同时遮光度过高对光强有遮挡作用，导致检测器接收的光强信号整体减弱，数据精确度下降；但是当遮光度过低时，由于系统中颗粒的衍射、散射很少，也不能得到较强的光信号，精确度也会受到影响^[9-10]。

综上所述，在测量过程中本系统遮光度最好不要超过30%，综合考虑选用5%～20%的遮光度范围进行测量。

3.3泵速的影响

固定遮光度条件为10%，考察进样系统的循环泵泵速对粒径分布的影响，结果见下图。由图4、图5可知，当泵速为600rpm时，溶液循环困难，样品分散效果不好，残差较大。随着泵速从1000rpm逐渐增加到2000rpm，样品分散较好，粒径和残差均比较理想。当泵速超过2000rpm时，液面比较剧烈，分散介质会产生气泡，容易进入系统影响测定结果。泵速达到3000rpm后，液面剧烈旋转，气泡充斥在分散介质中，径距变大，意味着有部分样品受到破坏，同时残差也显著变大。

图4 不同泵速下布比卡因脂质体的粒径分布

Fig.4 Particle size distribution of bupivacaine liposomes under different pump speed

图5 不同泵速下布比卡因脂质体的D50和残差变化

Fig.5 D50 and residual changes of bupivacaine liposomes under different pump speed

分散介质中的气泡是在粒径分析过程中产生假峰的根本原因。泵速的增加会增加气泡产生的概率，对测试结果产生很大影响^[11]。为了减少测试过程中气泡的产生，可以将分散介质进行脱气，从而避免气泡的形成。但是当泵速过低时，容易造成一些较大的颗粒无法在进样系统中循环，也会导致测量误差的增大。本试验中当泵速为600r/min 时，分散介质由于循环泵动力不足甚至无法在进样系统中循环，导致其无法进入检测光路进行测量。

因此，在测量过程中可以选择的合适泵速范围是1000～2000r/min。一般在进行测量时，可以使用1500r/min左右的泵速，在这一泵速下既可以保证较大颗粒在进样系统中循环，又可以降低气泡出现的概率。

3.4循环时间的影响

固定遮光度为10%，泵速1500r/min，考察样品循环时间对测定结果的影响。刚加入样品循环10s，此时分散还不完全，测量径距比较大；循环30-60s测定结果较好。随着循环时间的延长，样品的粒径有变大的趋势，当循环时间至10min，粒径已经增大至36μm。

由于样品和分散介质存在着渗透压差，在循环过程中分散介质会逐渐的进入到样品内部，从而导致样品胀大，出现粒径增加的情况。因此选定为30s作为测试样品的循环时间。

图6 不同循环时间的粒径分布

Fig.6 Particle size distribution of bupivacaine liposomes under different cycle time

图7 不同循环时间的D50和径距变化

Fig.7 D50 and residual changes of bupivacaine liposomes under different cycle time

3.5超声强度的影响

固定泵速为1500r/min，遮光度为10%，研究测试过程中使用超声波帮助分散对粒径分布的影响，结果如图8、图9所示。Mastersizer2000型激光粒径仪的进样系统最大超声功率是100W，强度为连续可调的20级，每增加一级可认为超声功率增加5W。

图8 不同超声强度下布比卡因脂质体的粒径分布

Fig.8 Particle size distribution of bupivacaine liposomes under different ultrasonic intensity

图9 不同超声强度下布比卡因脂质体的D50和径距变化

Fig.9 D50 and residual changes of bupivacaine liposomes under different ultrasonic intensity

由图8、图9 可知，超声波强度从0增大到15级，样品的粒径和径距变化不太大。一般在测量过程中使用超声波进行分散的目的是消除小颗粒间的团聚，使颗粒均匀分散在分散介质中。如果超声波强度过低，则不足以克服小颗粒间作用力，不能消除小颗粒间的团聚；若超声波的强度过高，则可能改变小颗粒的界面性质，反而增加小颗粒间相互作用力，使小颗粒发生团聚^[12-13]。

本体系中由于样品本身粒径较大，分布集中，细小颗粒的团聚比较少，正常条件下通过循环能够较好的将样品分散从而达到测定的目的。因此，在本体系的测量过程中不需要额外使用超声波进行分散。

3.6分散介质的选择

由于本体系制备的脂质体与作为分散介质的纯化水存在一定的渗透压差，因此分别考察了样品在三种分散介质中的粒径分布，结果见图10。

图10 不同分散介质下布比卡因脂质体的粒径分布

Fig.10 Particle size distribution of bupivacaine liposomes under different dispersion medium

由图10可见，在固定遮光度为10%，泵速为1500r/min，遮光度为10%，循环时间30s的条件下，三种分散介质下的粒径分布差别不大。

4.结论

使用Mastersizer2000型激光粒径仪测定布比卡因脂质体的粒径分布时，遮光度、泵速、循环时间和超声强度都会对样品的粒径分布情况产生影响。在本体系样品测试过程中，遮光度要求不超过30%，进样系统的泵速应在1000～2000r/min之间，循环时间在30s较为合适。在测量过程中不需要使用超声分散，否则将对样品造成破坏，对结果产生较大的误差；分散介质选择纯化水进行测量。

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作者简介：贺周扬，男，主管药师，主要从事药物新剂型和新技术研究。