云县仔猪大肠杆菌病原流行病学调查

云县仔猪大肠杆菌病原流行病学调查

郭子锟

云县幸福镇农业农村服务中心（兽医站） 云南云县 675801

摘要：仔猪大肠杆菌病是哺乳仔猪的多发病，严重影响着养猪业的发展。本次调查了7个母猪繁殖场50份病料均分离到大肠杆菌，分离率达100%。通过生化试验、药敏试验及血清型鉴定，分离菌株分属于5个血清型，即O2、O5、O8、O101、O4、其中O2型为本次分离的优势血清型，占分离菌株的50%。分离菌株均为耐药菌株，且临床症状典型，这表明大肠杆菌易产生耐药性，其耐药性能转移，菌株易变异的特点。通过本次调查基本摸清了云县仔猪大肠杆菌病流行的病原血清型。

关键词：仔猪 ；大肠杆菌 ； 分离 ； 鉴定

大肠杆菌是Escherioh在1885年首次发现，故而又命名为大肠埃希氏菌（E.coli）属于肠杆菌科，是G-小杆菌，无芽孢，卵圆型或杆状，长约1-3ｍ宽约0.4-0.7ｍ，往往是单独或成对。并不形成长链，其形态大小因菌株和生长环境的不同而有差异。大多数周身有鞭毛，能运动，有鞭毛的细菌也可能发生H-O的变异。一般不具备可见荚膜，用普通染料着色良好，有时两端略深，据《伯杰氏细菌分类手册》第1卷（1984）已知E.coli有o抗原17种,k抗原近80种，H抗原56种。因而构成了许多的血清型。E.coli在相当长的时期内一直作为正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到本世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽）常引起严重腹泻和败血症。随着大型集约化养殖业发展，病原菌对畜牧业所造成的损失已日益明显[1]。笔者调查了云县7个大型母猪繁殖场，共收到病料50多份，经分离培养均为大肠杆菌病料，分离率100%。送检病料均为典型仔猪大肠杆菌病病例的病料，这说明仔猪大肠杆菌病在云县流行比较普遍。经鉴定、药敏试验和因子血清试验结果证明，分离菌株均为耐药菌株，分属5个血清型。

2材料及方法

2.1病料来源 云县各大型母猪繁殖场送检典型病例病料。

2.2病原分离 将病料直接接种于肠道菌选择及鉴别培养基中，作常规划线分离，37℃下培养24小时，挑取可疑菌落接种于三糖铁琼脂斜面，纯培养及生化试验。

2.3生化试验[2]

2.3.1糖发酵试验 将分离纯培养菌株分别接种到棉子糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖培养基等，37℃下培养24-72小时后，观察反应。产酸者培养基变黄为阳性反应。

2.3.2M.R.试验，V-P试验，吲哚试验 将纯培养菌株接种到邓亨氏蛋白胨溶液当中，37℃培养48小时后。作如下试验：

2.3.2.1M.R.试验 加入甲基红试剂1-5滴于培养物当中，呈红色者为M.R.试验阳性反应，黄色或无变化者为阴性反应。

2.3.2.2V-P试验，取培养48小时的培养物，加入等量的V-P试剂，充分摇动试管，在数分钟内出现红色或粉红色者为阳性反应，如为阴性反应，应再在37℃中培养4小时再观察。

2.3.2.3吲哚试验 在培养物中加入Kovac试剂约0.5ml，轻轻摇动试管。变成红色者阳性反应，10分钟内未变色或无变化者为阴性反应。

2.3.3枸橼酸盐利用试验 将纯培养菌株接种到西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面上，37℃培养24小时后。观察反应。能利用枸橼酸盐者，枸橼酸琼脂会由绿色变成天蓝色，不变色或无变化者为阴性反应。

2.3.4H2S试验 取纯培养菌株穿刺接种于醋酸铅琼脂上，37℃培养48小时。观察结果变化，产生H2S者，醋酸铅琼脂会变成黑色，不产生H2S者，无变化为阴性反应。

2.3.5尿酶试验 取纯培养菌株接种于尿素培养基，37℃培养48小时后。观察结果。培养基变红，说明产碱，呈阳性反应。不变化者为阴性反应。

2.3.6触酶试验 取1ml 3%H2O2放入小试管中，然后从琼脂斜面上挑取一环菌落放入试管内。观察有无气泡产生。

2.4 因子血清试验 将待检菌株接种于普通琼脂斜面上，37℃培养18小时后，用5%的Nacl 溶液从琼脂斜面上冲洗菌苔并制成浓菌悬液,放入100℃水浴锅加热15分钟[4]。待冷却后，采用196种大肠杆菌因子血清，从中选取畜禽常见血清型（O1、O2、O5、O8、O10、O20、O36、O78、O81、O83、O85、O101）分别与分离菌株作玻片凝集试验，以鉴定其血清型。定型因子血清均由中国兽药监察所提供。

2.5 肠毒素试验 将分离的待检菌接种于普通琼脂斜面，37℃培养12小时，再移植于邓亨氏蛋白胨水中，37℃培养12小时，然后移种于CAYE-2培养液中每100ml培养液加蛋白胨水溶液1ml，同时以无菌手续加入50%葡萄糖0.5ml，恒温水浴振荡培养箱以120-240转每分钟连续振荡培养18小时,加入万分之一硫柳汞,放置过夜杀菌,再以300转/分离心30分,取上清液.选用2-3Kg家兔,手术前,先饥饿48小时,按手术常规仰卧保定,局部麻醉,切开腹壁,暴露回肠,用外科接扎线分段双重接扎,每段5cm作为试验,两个试验段之间间隔2cm，每株待检菌上清液注射一个肠段，每段注射1ml，另选一个肠段注射1ml CAYE-2培养基作阴性对照，注射完毕缝合切口，禁食18小时处死试验兔，取出结扎肠段，测定每个肠段的长度和液体潴积量，以每cm肠段内液体的ml数表示肠毒素的毒力强度，每cm段内蓄液量≥1ml者为阳性反应[3] 。

3结果

3.1培养特性 分离菌株在麦康凯琼脂上长成圆形、边缘整齐光滑、稍隆起、潮湿、红色菌落。普通肉汤均匀混浊。

3.2生化特性 分离菌株能利用葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、乳糖、绵子糖、山梨醇、甘露醇产酸产气，三糖铁斜面和底部均产酸变黄，尿酶试验阴性，吲哚试验阳性，枸橼酸试验阴性，硫化氢试验阴性，触酶试验阳性，MR试验阳性，VP试验阴性，与大肠杆菌相符。

3.3因子血清试验，

因子血清试验结果显示，分离菌株分别属于5个血清型，即O2、O5、O8、O101、O4。其中，优势血清型O2占50%。

3.4 肠毒素试验 除对照肠段外，其余试验肠段内的液体潴积量都明显增多。每cm肠段内蓄积量后大于1ml阳性。另外，可见试验肠段明显出血。

4讨论

4.1因采集的病料均来源于典型仔猪腹泻病病猪，试验结果表明分离菌株均为致病性大肠杆菌，分属5个血清型即O2、O5 、O8、O4、O101，其中O2型为本次分离的优势血清型，占分离菌株的50%。这说明大肠杆菌在流行过程中菌株易产生变异的特点。本次分离的优势血清型与姚俊等2001年分离到的不同。O2型作为优势血清型在云县尚属首次，目前县内尚无O5血清型在猪上致病的报道。

4.2本次病原调查旨在摸清云县近年来仔猪大肠杆菌病流行的病原血清型，为以后菌苗的研究奠定基础。大肠杆菌病是一个古老的传染病，由于其病原在流行过程中易产生变异，在防治过程中给基础兽医工作者带来极大困难。通过病原血清型调查，指导菌苗的研究，开发相应的生物制品，以供生产实践中应用，解决实际困难。

4.3仔猪大肠杆菌病是哺乳仔猪的多发病，仔猪大肠杆菌病在流行过程易产生耐药性，在遗传特性上极易引起变异。已经发现本菌的耐药性和产生肠杆菌毒素，溶血素以及产生K88抗原的特性都能通过质体转移到另一种菌的菌体中去，尤其耐药性转移问题更为严重。这给治疗增加了难度，在治疗当中对病畜使用抗血清治疗有改善病况的作用，但初生幼畜肠道疾病的预防主要决定于母畜初乳中所供应的母源抗体。由于各场的致病性大肠杆菌的菌型不一致，很难使用同一种菌苗而获得普遍的效果，而各场的菌型在不引进外来带菌品种的前提下就比较单一，而从本场分离得到的菌株制成的自家菌苗接种临产母畜以使幼畜获得天然被动免疫，就能得到很好的效果[5]。在治疗时尽可能先作药敏试验，选择较敏感药物，如庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、磺胺嘧啶等。并辅以对症治疗。近年来，使用活菌剂，如促菌生、调痢生等治疗，有良好功效。用药时尽量不用单一抗生素治疗，应采用多种抗生素交替使用，避免耐药性的产生。

4.4控制本病重在预防。怀孕母猪应加强产前产后的饲养和护理，仔猪应及时吮吸初乳，饲料配比适当，勿使饥饿或过饱，断乳期饲料不要突然改变。对密闭关养的，尤其要防止各种应激因素的不良影响。近年来使用一些对病原性大肠杆菌有竞争抑制作用的非病原性大肠杆菌（如NY-10菌株、SY-30菌株等）以预防仔猪黄痢的菌群调整疗法，已在国内某些地区推行，收到了较好的效果[1]。另有报道显示用分离菌株作为免疫原免疫产蛋鸡待产生抗体后，收集鸡蛋制备卵黄抗体饲喂初生仔猪预防和治疗仔猪黄、白痢效果显著[6]。

参考文献

[1]蔡宝祥主编 . 家畜传染病学 .（第3版）北京.中国农业出版社，2000，05.

[2]陈天寿主编 .微生物培养基的制造与应用 .（第1版）.北京.中国农业出版社，1995，06.

[3]曹澍泽 .兽医微生物学及免疫学技术 .（第1版）北京.北京农业出版社，1992，05.

[4]汪天成 ，叶祝年，王云方. 兽医实验检验手则.（第1版）上海.上海科技出版社，1984，06.

[5]甘肃农业大学主编 .兽医微生物学. (第2版)北京.北京农业出版社，1991，05.

[6] 房祥军,邹晓庭.卵黄抗体的特性及其在仔猪腹泻防治上的应用.中国兽药.第39卷 2005，04.

作者简介:郭子锟，男，汉族，云南云县人，1976年12月生，中共党员，大专文化，动物医学专业，兽医师，从事畜牧兽医工作。

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