FⅠ制作工艺优化对人纤维蛋白原 收率和关键质量指标的影响分析

廖凯 ，陈新朋 ，李洪强 ，吴浩，范苏康，罗军（ 通讯作者）

（博雅生物制药集团股份有限公司，江西抚州 344000）

摘要：目的 优化人纤维蛋白原FⅠ制作工艺参数，保证产品质量的同时，提高产品收率。方法 将FⅠ制作的pH值由6.9调整至7.5，温度由-1℃调整至-3℃，对优化前后的人纤维蛋白原FⅠ沉淀量和关键质量指标(纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量、凝固活力) 进行统计分析。结果 FⅠ制作的pH值调整和温度降低分别使人纤维蛋白原FⅠ沉淀量提高了4.7%和6.5%，且关键质量指标均未发生显著变化。结论 FⅠ制作过程pH值和温度参数的优化，有效提高了FⅠ沉淀量得率，未影响产品质量。

关键词：FⅠ制作工艺优化；Fg；关键质量指标

人纤维蛋白原（Human Fibrinogen，Fg）系由健康人血浆，经分离、提纯，并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素，主要用于治疗产后大出血及因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍^[1]。Fg属性血液制品中的因子类产品，在血浆中含量约3g/L。

本公司采用改良后低温乙醇工艺生产Fg，现对FⅠ制作工艺优化对人纤维蛋白原收率和关键质量指标的影响分析报道如下。

1 材料与方法

1. 1. 材料 原料血浆和注射用水（博雅生物制药集团股份有限公司）；乙醇（湖南湘易康制药有限公司）；枸橼酸钠、蔗糖、聚山梨酯-80（湖南尔康制药股份有限公司）；氯化钠（河北华晨药业有限公司）；稀盐酸（成都华邑药用辅料制造有限责任公司）；磷酸三丁酯（国药集团化学试剂有限公司）；Fg生产用的自控系统、反应罐、温控系统（上海灿实实业有限公司）；酸度计（上海精密科学仪器有限公司）；液相色谱仪（日本岛津公司）；高效液相色谱仪（waters corportiin）；微电脑电热恒温水浴槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

   2. 方法

      1. 调整FⅠ制作pH值 在纤原FⅠ制作生产过程中，调整醋酸-醋酸钠缓冲液的加量，制作pH值由6.9调整至7.5。

      2. 提高FⅠ制作温度 在纤原FⅠ制作生产过程中，在自控系统中制作温度由-1℃调整至-3℃。

      3. 考察质量指标

1.2.3.1统计分析优化前后连续5批纤原FⅠ沉淀量及关键质量属性（纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量、凝固活力）。纯度检测采用《药典》三部Fg成品检定；枸橼酸离子含量检测采用《药典》通则3108枸橼酸离子含量测定法测定；氯离子含量检测采用《药典》通则3107氯离子含量测定法测定；盐酸精氨酸含量检测采用《药典》通则3123盐酸精氨酸含量测定法测定；凝固活力检测采用《药典》三部Fg原液检测方法检定。

1. 3. 统计学分析 采用双样本t检验-平均值对样本分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1调整FⅠ制作pH值考察结果

FⅠ沉淀量增加，与调整前相比上升4.7%，P=0.001，小于0. 05；对相应批次制品的关键质量指标(纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量、凝固活力) 进行检测，发现调整前后上述关键质量指标皆有不同程度的变化，但 P 均大于0. 05，可以认为调整FⅠ制作pH值，对Fg关键质量指标无影响，具体见表 1。

表1 FⅠ制作pH值调整前后FⅠ沉淀量和关键质量属性分析

* 与优化前比较收率 t = -5.21，P＜0. 05; 关键质量属性纯度 ＊P＞0. 05，枸橼酸离子含量 ※P＞0. 05，氯离子含量 ФP＞0. 05，盐酸精氨酸含量 △P＞0. 05，凝固活力£P＞0. 05

2.2.降低FⅠ制作温度考察结果

FⅠ沉淀量增加，与降低前相比上升6.5%，P值等于0.002，小于0. 05；对相应批次制品的关键质量指标(纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量、凝固活力) 进行检测， 发现调整前后上述关键质量指标皆有不同程度的变化，但 P 均＞0. 05，可以认为降低FⅠ制作温度，对Fg关键质量指标无影响，具体见表 2。

表2 FⅠ制作温度降低前后FⅠ沉淀量和关键质量属性分析

* 与优化前比较收率 t = -6.09，P＜0. 05; 关键质量属性纯度 ＊P＞0. 05，枸橼酸离子含量 ※P＞0. 05，氯离子含量 ФP＞0. 05，盐酸精氨酸含量 △P＞0. 05，凝固活力£P＞0. 05

3讨论

低温乙醇法是世界血浆蛋白分离工业化生产的基础，随着科技迸步，血液制品分离纯化方法日益增多，如离心法、辛酸盐沉淀法、压滤法、层析法、超滤法等。目前，提取纤原的原料主要包括低温乙醇工艺产生的FⅠ沉淀和血浆冷沉淀两种，国内外大多数血液制品厂家以 FⅠ沉淀作为提取纤原的原料^[2,3]。血浆去除冷沉淀经FⅠ制作、离心得FⅠ 沉淀，FⅠ制作对FⅠ沉淀的得率显得尤为重要^[4]。本试验对FⅠ制作进行了探索，pH值由6.9调整至7.5，温度由-1℃降低至-3℃，统计分析FⅠ沉淀得率和待包品纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量及凝固活力等关键质量属性，结果显示，调整FⅠ制作的pH值和温度分别使FⅠ沉淀量提高了4.7%和6.5%，待包品的纯度、枸橼酸离子含量、氯离子含量、盐酸精氨酸含量及凝固活力均未发生显著变化。

蛋白质是两性电解质，其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关，各种蛋白质因氨基酸残基组成不同，等电点也不一样^[5,6]。当溶液在特定pH值的条件下，蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等(总净电荷为零)时，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，蛋白质在等电点时，因为没有相同电荷而互相排斥的影响，所以最不稳定，溶解度最小，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，因而沉淀析出。优化FⅠ制作的pH值，pH值由6.9调整至7.5，更接近FⅠ制作溶液的等电点，从而提高FⅠ沉淀得率。FⅠ制作添加乙醇会发生水合作用，从而产生放热现象，温度升高可能造成蛋白质的变性，降低FⅠ制作的温度，有效保护Fg在制作过程不易变性，温度低，蛋白质的溶解度低^[7]。沉降的FⅠ沉淀也不易再次溶解，从而提高FⅠ沉淀得率。

提取和纯化Fg的方法有低温乙醇沉淀法和甘氨酸沉淀法，二者单独或组合应用，层析技术的应用可进一步提高产品纯度^[8,9]。高回收率和更好的产品质量指标决定了Fg的低温乙醇生产工艺将逐步为低温乙醇-层析结合工艺或全层析工艺所替代。

参考文献

1.国家药典委员会编. 中华人民共和国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社, 2015.

2.张庭喜，孔维权，王连群，等. 一种从 Cohn 组分 I 沉淀分离纤维蛋白原的方法：CN104387466A 「P」. 2015-03-04.

3.金昌燮，鱼湖权，王冰峰，等. Fg的生产方法：CN1017- 03763A 「P」. 2010-05-12.

4.李斌. Fg分离纯化工艺研究「D」.济南：山东大学，2013.

5.Tomii K . Protein Properties - ScienceDirect[J]. Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology, 2019, 2:28-33.

6.Kantardjieff K A , Rupp B . Protein isoelectric point as a predictor for increased crystallization screening efficiency.[J]. Bioinformatics, 2004, 20(14):2169-2170.

7.Noskov S Y , Lamoureux G , Benoît Roux. Molecular dynamics study of hydration in ethanol-water mixtures using a polarizable force field.[J]. Journal of Physical Chemistry B, 2005, 109(14):6705-13.

8.雷文成，时凯，刘国荣，等. 柱层析法从组分 I 中提取Fg的方法：CN102212129A 「P」. 2011-10-12.

9.林孝发, 张运佳, 孙兆健,等. 柱层析法纯化人血纤维蛋白原及其药理功能研究[J]. 现代生物医学进展, 2017, 17(011):2041-2045.

Δ通讯作者：罗军（1987.02-），男，制药工程中级工程师，主要从事血液制品工艺研究工作。