不同加工工艺的地黄褐变酶活性比较研究

不同加工工艺的地黄褐变酶活性比较研究

苏雅琼，张璐，杨莹，梁嘉窈，毛伊敏，王珊 *

陕西国际商贸学院 陕西咸阳 712046

摘要：本研究对鲜地黄、生地黄和熟地黄中的褐变酶活性进行检测比较。本实验采用体外的检测方法对不同加工工艺的地黄中的褐变酶活性进行检测，结果发现鲜地黄、生地黄及熟地黄中的PPO酶活性为125.4 U、54.6 U、265.8 U/(g.min)；结果发现鲜地黄、生地黄及熟地黄中的POD酶活性为95.6 、15.4、165.3U/(g.min)。

关键词：地黄；不同加工工艺；褐变酶

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根，始载于《神农本草经》，并被列为上品^[1]。在全国各地均有栽培，但其主产于河南、山东、山西等省，以河南温县、孟县、武陟等地栽培历史最长，产量最高，其于秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用；或将地黄缓缓烘焙至约八成干，前者习称“鲜地黄”，后者习称“生地黄”，其中鲜地黄性寒，味甘、苦，偏于清热生津，凉血止血；生地黄性甘、寒，长于清热凉血，养阴，生津。在地黄生产、储存过程中地黄药材特别容易变黑^[2-3]，鲜药材的腐烂和颜色变黑主要是由于其发生了酶褐变，因此本实验对地黄不同加工工艺的地黄中褐变酶活性进行比较研究。

1 材料

1. 1. 实验仪器

梅特勒-托利多XSE150分析天平；TGL 20MW台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；普析通用T6 UV-VIS分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试剂与药材

邻苯二酚；愈创木酚，聚乙烯吡咯烷酮生产厂家均为天津市光复精细化工研究所；十二水合磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，乙二胺四乙酸二钠，30%过氧化氢生产厂家均为北京化工厂。鲜地黄、生地黄及熟地黄均购自道地药材市场为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根及炮制品。

2 实验方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 PBS的配制 A母液：精密称取Na₂HPO₄^.12H₂O 35.81 g，用蒸馏水定容至500 mL得到0.2 mol^.L^-1的磷酸氢二钠溶液，即为A母液；

B母液：精密称取NaH₂PO₄^.2H₂O 15.60 g，用蒸馏水定容至500 mL得到0.2 mol^.L^-1的磷酸二氢钠溶液，即为B母液；

pH6.0的PBS：分别精密移取A母液12.5 mL和B母液112.5 mL，再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na₂，用蒸馏水定容至500 mL即得0.05 mol^.L^-1 PBS；

PH7.8的PBS：分别精密移取A母液112.5 mL和B母液12.5 mL，再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na₂，用蒸馏水定容至500 mL即得0.05 mol^.L^-1 PBS。

2.2.2 0.05 mol^.L^-1邻苯二酚的配制 精密称取邻苯二酚0.55 g，加蒸馏水定容至100 mL，即得。

2.2.3 2%H₂O₂的配制 精密移取6.7 mL 30% H₂O₂，加蒸馏水定容至100 mL，即得。

2.2.4 愈创木酚的配制 精密移取愈创木酚555 μL，加PBS（pH7.8）定容至100 mL，即得，4˚C避光保存。

2.3 地黄粗酶液的制备

2.3.1 PPO的制备 从-80 ˚C冰箱中取出不同剂量硫熏亳菊新鲜样品，精密称取0.5-2 g，置于研钵中，加入2 mL4˚C下预冷的0.05 mol^.L^-1PBS（pH6.0）研磨成匀浆，将匀浆转移至15 mL离心管中，再用6 mLPBS分次冲洗研钵，然后于4˚C 10000 rpm条件下离心15 min，将上清液转移定容至10 mL，于4˚C 10000 rpm条件下离心15 min，得到的上清液即为PPO粗酶液。

2.3.2 POD的制备 操作同“PPO酶的制备”，只是将0.05 mol^.L^-1PBS代替0.05 mol^.L^-1PBS进行提取制备。

2.4 酶活性测定

2.4.1 PPO酶活性测定步骤 给各试管中分别加入PBS（pH6.0）1.5 ml、邻苯二酚1ml，各试管立即放入37 ˚C的水浴锅中保温10 min以上，混匀，在410 nm处调零，再向测定管中加入0.5 mL粗酶液，混匀后立即计时并测定，每30秒读取一次，共测2 min，做三组重复实验。待测定管全部测定完后，计算酶活性。

2.4.2 POD酶活性测定步骤 给各试管中分别加入PBS（pH7.8）2.9mL、H₂O₂1mL、愈创木酚1mL，将各试管立即放入37 ˚C的水浴锅中保温5 min以上，混匀，在470 nm处调零，再向测定管中加入1 mL粗酶液，混匀后立即计时并测定，每30秒读取一次，共测2 min，重复测定3次，待测定管全部测定完后，计算酶活性。

3 实验结果

3.1 PPO酶活性结果

通过实验检测，结果发现鲜地黄中的PPO酶活性为125.4 U/(g.min)，生地黄为54.6 U/(g.min)，熟地黄265.8 U/(g.min)。

3.2 POD酶活性结果

通过实验检测，结果发现鲜地黄中的POD酶活性为95.6 U/(g.min)，生地黄为15.4U/(g.min)，熟地黄165.3U/(g.min)。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].中国医药科技出版社, 2015: 101.

[2] 齐笑笑. 果蔬采后酶促褐变机理及控制方法研究进展［J］. 北方园艺, 2017 (11): 190-194.

[3] 陈桂, 李维, 张海洲, 等. 多酚氧化酶的提取及分离纯化研究进展［J］. 食品工业科技, 2018 (3): 330- 332.

作者简介：苏雅琼，女，陕西国际商贸学院医药学院药学2017级，

*指导教师简介：王珊（1987-）,女（汉），讲师，硕士，主要从事中药化学与质量控制的教学与科研工作；

项目编号：陕西省大学生创新创业项目，S202013123039。