多重PCR应用的科普知识

多重 PCR应 用的科普知 识

鲁健康

西昌市疾病预防控制中心 ，四川 西昌 615000

虽然说分子生物学技术离我们很遥远，但是随着疫情的出现，大多数人也对多重PCR技术有了更加深层次的理解。比如在新冠疫情的检验当中，人们就需要通过多重PCR技术来检验人体的病毒感染情况。不过，虽然说多重PCR技术已经相对较为成熟，但在其操作的过程当中还是有较多的问题。因此，为了使更多的人能够充分了解到多重PCR技术，本文分析了多重PCR技术与普通PCR技术之间的区别并举出了相关的应用场景，希望能够给相关从业者带来一点思考。

一、多重PCR技术是什么

多重PCR作为PCR技术的延伸技术，其在生物学中发挥了较强的作用，尤其是在病毒检测遗传病以及这些基因的分型鉴定上，都有着极强的优势。虽然说其功能较为强大，但其运作原理并不复杂。首先，PCR技术的原名叫做聚合酶链式反应，它通过一种特殊手段来放大某一段特定的DNA分段，从而使微量的DNA能够进行大量繁殖。其实在人体当中，这种反应每时每刻都在进行，而PCR技术只是将反应的过程搬到了体外。而多重PCR技术与PCR技术并没有很大的差别，只不过是在反应体系当中增加了引物数量。一般情况下，PCR技术的引物通常只为一对，而多重PCR的引物数目可以达到更多。但与此相对的是，其引物的处理难度也成倍增加。

二、多重PCR的具体应用

多重PCR技术的应用领域非常广泛，比如可以应用在食品检测、遗传学、植物生物学、医学以及ngs当中，都可以找到他的影子。但受限于文章篇幅的影响，本文将应用重点集中在了食品检测以及医学病毒检测上。

（一）食源性疾病的检测

（1）食物中毒的诱因检测

在2018年8月15号的桂林食物中毒事件当中，92人因食物中毒进行了入院治疗。究其原因，是发现食物当中混入了沙门氏菌，从而导致人出现了严重腹泻。沙门菌会迅速繁殖在腐败的肉质当中，并会导致人出现急性胃炎伤寒等症状。作为肠杆菌科的一种单一病原菌，其广泛存在于自然界当中。不过随着多重PCR技术的出现，科学家能够轻易的利用沙门菌的引物检测出食物中是否有沙门菌。根据数据统计显示，多重PCR技术的检测准确率率达到95%，大大超过了同类的检测技术。另外，在检测过程当中，多重PCR技术还能表现出较强的特异性，这也使其逐渐成为未来食品检测的发展方向。

（2）混合病原菌的检测

在食品检验当中，沙门菌并非是单一出现的菌种，也经常会同大肠杆菌、志贺菌等形态结构相较类似的菌种一同出现。在传统的菌种检测当中，虽然能够检测出菌落的存在，但无法对种类进行详细区分，这也使得食品加工无法产业对其进行针对性的灭菌处理。而随着多重PCR技术的出现，食物检测机构能够快速的对三种病人进行检测，并区分出详细种类，以便于进行针对性处理。另外在检测成本上的控制上，多重PCR技术也相对比较低廉，从而能够大大降低食物检测的成本。

（3）食品安全的基础检测

在特殊的食物处理当中，多重PCR技术还可以用于非致病菌的检测。 比如在牛奶的真空包装当中，食物生产商就可以利用多重PCR技术来对包装中的乳酸菌含量进行检测，以便预估食物的保质期。当然，也可以判断包装环境中是否有杂菌，从而能够第一时间对其进行抑制，以免造成食物腐坏。

（二）病毒检验

在神经系统侵入病原体的相关检测上，多重PCR的实际价值就得到了充分的体现。比如在当神经中枢系统遭到病原体侵入时，就会使神经出现感染性病变，如果情况较严重，则还可能导致人的死亡。所以，尽可能的检测出侵入体的种类就成了治疗中枢神经系统感染的首要条件。但由于中枢神经的位置较为特殊，所以传统的监测方式也很难达到检测目的，所以在多重PCR技术出现以前，中枢神经系统感染的治愈率非常低，且死亡率也居高不下。不过随着多重PCR技术的出现，医生可以收集患者的脑脊液来进行培养，以检测大脑中的细菌感染种类。虽然说从结果上来讲，多重PCI技术的检测结果依然有些许误差，但比起同类的检测方式，其准确程度已经比较可观。比如在MEMP-19的检测当中，多重PCR技术就已经有较了高的参考价值。

三、多重PCR技术的应用难点

虽然说多重PCR技术的运用已经相对较为成熟，在操作的过程当中，还是存在着不少的技术难点，为了方便相关人员进行参考，本文将其列举在下方：

（一）多靶点扩增条件差异性过大

与PCR技术不同，多重PCR技术的靶点较多，所以其扩增条件也有一定差异性。因此在对应引物的选择上，需要实验人员进行大量的时间来对引物的种类与实验环境进行总结。但即便如此，多重PCR技术的短板效应依旧是十分明显。

（二）反应条件控制困难

在反应过程当中，基因的扩增会受到延伸温度的影响，而实验当中对退火温度的调整也很难消除其不良影响。因此在延伸温度的控制上，相关人员可以将其调整到66度～71度之间，并尝试根据实验的不同类型来进行动态调整，以达到最好的扩增效果。而在反应时间的控制上，由于多重PCR技术会使用到较多的引物对，所以在反应过程当中，相关人员可以根据目标基因片段的大小和酶的作用效率来确定基因的延伸时间。而在整体循环数的控制上，技术人员只要将循环数控制在28~31个循环即可。若循环数过小，会大大降低目标基因的基础生成量。

（三）引物处理困难

在引物的选择过程当中，引物的长度要控制在一定的范围内，一般情况下15~30bp即可。另外，引物对之间不能出现互补的情况，以免其反应聚合，从而导致二聚体的出现，影响扩增质量。为了避免二聚体的出现，相关人员还可以设置一些特殊的结构，从而阻止其出现非特异性扩增。如果在操作当中已经出现了引物二聚体，就需要设计人员重新对引物进行设计，以便于从根本上解决其聚合的问题。当然，如果条件不允许，也可以尝试改变退火温度，并尝试提高培养模板的浓度，再观察反映情况。