手性高效液相色谱法测定酒石酸阿福特罗中对映异构体

手性高效液相色谱法测定酒石酸阿福特罗中对映异构体

陈素洁1 *，孙井龙，单冰冰

南京科默生物医药有限公司，南京 210046

摘要：建立了一种测定酒石酸阿福特罗对映异构体的手性高效液相色谱法，用于R,R-构型阿福特罗光学纯度的分析研究。采用α1-酸性糖蛋白键合手性柱（CHIRALPAK®AGP，4.0 mm×100 mm，5 μm）为色谱柱，以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠2.34 g和磷酸氢二钠4.33 g，加1000 ml水使溶解）-10%异丙醇（95：5）为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为210 nm，柱温为25℃。该方法下S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗之间的分离度大于3.0；S,S-阿福特罗质量浓度在0.10~2.52 μg/ml范围内线性关系良好，线性方程为y=1.3587x+0.0146，r=0.999；S,S-阿福特罗的定量限和检测限浓度分别为0.10 μg/ml和0.05 μg/ml；低、中、高3个浓度的S,S-阿福特罗回收率（n=3）分别为92.2%、95.5%、100.0%，RSD（n=9）为3.7%；供试溶液在室温放置24小时内稳定性良好。经检测，四批酒石酸阿福特罗中仅一批检出S,S-阿福特罗0.02%，其余三批均未检出。结果表明，所建立的方法经方法验证可准确可靠地测定酒石酸阿福特罗中的对映异构体。

关键词：酒石酸阿福特罗；对映异构体；手性高效液相色谱法

中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：

The determination of Arformoterol Tartrate by Chiral HPLC

CHEN Su-jie^1*，SUN Jing-long，SHAN Bing-bing

1. Nanjing Caremo Biomedical Co. Ltd., Nanjing 210046,China)

ABSTRACT：To establish a chiral HPLC method to determination Arformoterol Tartrate enantiomers for optical purity analysis research of R,R- Arformoterol. The detection method is α 1-acid glycoprotein bonded chiral column CHIRALPAK®AGP(4.0mm×100mm，5μm) as a chromatographic column.The mobile phase was phosphate buffer solution(2.34g sodium dihydrogen phosphate and 4.33g sodium dihydrogen phosphate, dissolved with 1000ml water) –10%(v/v)isopropanol (95:5)at a flow rate of 1.0 ml/min.The column temperature was 25℃ and the detection wavelength was 210 nm. The resolution between the peaks of S,S- Arformoterol and R,R- Arformoterol was more than 3.0. The method was found to show good linearity over the concentration of S,S- Arformoterol range of 0.10~2.52 μg/ml. The linear equation was y=1.3587x+0.0146, and the regression coefficient was 0.999. The limit content of quantification and limit content of detection of S,S- Arformoterol were 0.10 μg/ml and 0.05 μg/ml, respectively. The recoveries of S,S- Arformoterol (n=3)were 92.2%, 95.5% and 100.0% respectively at the concentration level of low, medium and high, with the RSD(n=9)of 3.7%.The test solution was stable for at least 24h at 25℃. After testing, only one of the four batches of Arformoterol Tartrate was detected, S,S-Arformoterol was 0.02%, and the other three batches were not detected.Results show that the method by the methods validation, the method can be accurately and reliably used for determination arformoterol tartrate enantiomers.

KEY WORDS： arformoterol tartrate; enantiomer; chiral HPLC

酒石酸阿福特罗（arformoterol tartrate）适用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者支气管收缩的长期维持治疗，包括慢性支气管炎和肺气肿。本品为一种选择性长效β2受体激动剂，可激活体内腺苷酸环化酶，该酶能使三磷酸腺苷（ATP）转化为3-5-环磷腺苷（cATP），细胞内cATP量增加可松弛支气管平滑肌，并能减少过敏性介质从细胞特别使肥大细胞中释放。体外试验显示，本品能抑制人肺肥大细胞中组胺、白三烯等介质的释放^[1]。

阿福特罗存在有2个不对称碳原子，本品化合物为R,R构型结构，其存在S,S-型、S,R-型、R,S-型3个异构体。其中阿福特罗与S,S-型异构体互为对映异构体，与S,R-型及R,S-型互为非对映异构体，已有相关文献及研究收载了其非对映异构体的检测方法^[2]，由于S,S-型的分离难度较大，国内外尚未有关于酒石酸阿福特罗对映异构体的检测方法的相关文献报道。本文采用高效液相色谱法^[3]在反相条件下采用手性固定相^[4-6]分离检测酒石酸阿福特罗对映异构体，所建立方法具有操作简便，灵敏度高，精密度好的特点，可为酒石酸阿福特罗原料及其制剂的产品控制提供参考。

R,R构型阿福特罗（R,R-Arformoterol） S,S构型阿福特罗（S,S-Arformoterol）

图1 R-R构型和S-S构型阿福特罗结构式

Fig. 1 R,R-Arformoterol and S,S-Arformoterol structure of aranidipine

1 仪器与试药

Thermo Ultimate3000高效液相色谱系统（包括自动进样器、柱温箱、VWD检测器、Chromeleon色谱数据工作站；Thermofisher公司）；CHIRALPAK®AGP，4.0 mm×100 mm，5 μm色谱柱（填料：α1-酸性糖蛋白^[7-8]）；大赛璐公司）；BSA124S型电子天平（Sartorius公司）。

异丙醇、乙腈为色谱纯（Tedia公司），磷酸二氢钠、磷酸氢二钠为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。酒石酸阿福特罗样品（批号：CM0625、CM0710、CM0812、CM0902）由南京科默生物医药有限公司提供。S,S-阿福特罗对照品（批号：CM0520S，化学纯度：97.5%，光学纯度：98.0%）、R,R-阿福特罗对照品（批号：CM0520R，化学纯度：99.7%，光学纯度：99.5%）均由南京科默生物医药有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

溶剂：乙腈-水（10：90）。样品溶液：取酒石酸阿福特罗适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1 ml中约含0.25 mg的溶液，即得。对照溶液：精密量取样品溶液适量，加溶剂稀释制成每1 ml中约含2.5 μg的溶液，即得。S,S-阿福特罗对照品母液：精密称取S,S-阿福特罗对照品适量，加溶剂定量稀释成每1 ml中约含0.1 mg的溶液，即得。R,R-阿福特罗对照品母液：精密称取R,R-阿福特罗对照品适量，加溶剂定量稀释成每1 ml中约含0.1 mg的溶液，即得。系统适用性溶液：精密称取R,R-阿福特罗对照品及S,S-阿福特罗对照品各适量，加溶剂溶解制成每1 ml中各约含0.25 mg、1 μg的溶液，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：CHIRALPAK®AGP，4.0 mm×100 mm，5 μm；流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠2.34 g和磷酸氢二钠4.33 g，加1000 ml水使溶解）-10%异丙醇（95：5）；流速：每分钟1.0 ml；检测波长：210 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。

2.3 分离度试验

精密量取系统适用性溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，典型色谱图见图2。结果表明，在选定的色谱条件下，R,R-阿福特罗峰与S,S-阿福特罗峰能够完全达到分离，出峰时间适宜，两个色谱峰之间的分离度大于3.0；表明本方法的专属性良好。

2

1

1. R,R-阿福特罗（R,R- Arformoterol, t_R=11.147 min） 2. S,S-阿福特罗（S,S- Arformoterol, t_R=19.913min）

图2 系统适用性溶液HPLC图谱

Fig.2 HPLC chromatography of system solution

2.4 检测限与定量限

取S,S-阿福特罗对照品溶液用溶剂逐级稀释，分别以基线噪声的10倍信噪比和基线噪声的3倍信噪比作为定量限和检测限浓度。在选定的色谱条件下，S,S-阿福特罗定量限浓度为0.10 μg/ml，检测限浓度均为0.05 μg/ml。

2.5 线性与范围

精密称取S,S-阿福特罗对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 ml约含5 μg的溶液，作为线性储备液；精密量取储备液0.4 ml、0.6 ml、1 ml、2 ml、5 ml分别置10 ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，作为各梯度浓度溶液。精密量取各梯度浓度溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以质量浓度C为横坐标，以峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，S,S-阿福特罗的回归方程为：y = 1.3587x + 0.0146，r=0.999。结果表明，S,S-阿福特罗质量浓度在0.10~2.52 μg/ml范围内，呈良好的线性关系。

2.6 回收率试验

精密称取S,S-阿福特罗对照品适量，加溶剂溶解制成每1 ml中约含5 μg的溶液，作为S,S-阿福特罗对照品储备液；精密量取上述储备液适量，加溶剂稀释制成0.5 μg/ml的溶液，作为对照品溶液；取酒石酸阿福特罗适量，精密称定，分别按0.1%、0.2%、0.3%的量加入S,S-阿福特罗对照品储备液，用溶剂配制成每1 ml含酒石酸阿福特罗0.25 mg的供试品溶液，平行配制3份。分别精密量取上述各供试液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按“2.2”项下色谱条件分析，按外标法以峰面积计算，S,S-阿福特罗低、中、高3个浓度的回收率（n=3）分别为92.2%、95.5%、100.0%，RSD（n=9）为3.7%，RSD<5.0％。

2.7 进样精密度试验

精密量取“2.6”项下配制的对照品溶液20 μl，连续进样6针，以峰面积计算S,S-阿福特罗的RSD（n=6）为0.54%。试验结果见下表1。

表1 进样精密度试验结果（n=6）

Tab.1 Results of sampling precision tests（n=6）

2.8 重复性试验

取酒石酸阿福特罗适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释成每1 ml中约含0.25 mg的溶液，作为供试品溶液，平行配制6份样品；分别精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，作为自身对照溶液；照“2.6”项下对照品溶液溶液配制方法配制对照品溶液；分别精密量取上述供试液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按“2.2”项下色谱条件分析，按照自身对照法和外标法计算酒石酸阿福特罗中S,S-阿福特罗的含量。结果表明，两种算法下检测结果一致，均为未检出，故可采用更为简便的自身对照法代替外标法进行计算。试验结果见下表2。

表2 重复性试验结果（n=6）

Tab.2 Results of repeatability tests（n=6）

2.9 溶液稳定性试验

取“2.8”项下供试品溶液，精密量取20 μl，分别于0、4、8、12、16、24小时注入液相色谱仪；记录色谱图，考察溶液稳定性，结果表明，在24小时内S,S-阿福特罗峰面积均为0（未检出），表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

2.10 S,S-阿福特罗的含量测定

取多批次的酒石酸阿福特罗，按照“2.1”项下的溶液配制方法和“2.2”项下的色谱条件分析，以自身对照法计算酒石酸阿福特罗样品中S,S-阿福特罗的含量，经检测，多批次酒石酸阿福特罗中均未检出S,S-阿福特罗。各批次检测结果见下表3。

表3 多批次酒石酸阿福特罗中的S,S-阿福特罗的含量检测结果

Tab.3 The S,S-Arformoterol content of Arformoterol tartrate with various batches

3 讨论及结论

色谱柱对分离的影响 在条件摸索过程中尝试了十八烷基键合聚乙烯醇填料(Shodex Asahipak ODP-50 4E)色谱柱与多糖衍生物涂敷型填料(Chiralcel AD-H与OD-H、Chiral ART Cellulose-SB、菲罗门Chiral MD-RH)等色谱柱，S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗均达不到基线分离；阿福特罗含有甲酰胺结构，改用α1-酸性糖蛋白键合填料（CHIRALPAK®AGP）色谱柱，该色谱柱对酰胺类的手性化合物具有较强的分离能力，采用100 mm色谱柱还可以缩短分析时间，综上，在蛋白质键合手性柱的作用下S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗可以较好地分离，分离度大于3.0。

流动相比例对分离的影响 将流动相中水相的比例分别调整为94%、95%、96%。结果显示，水相比例越高，S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗的保留时间均明显延长，但两者的分离度变化不大。为确保方法的耐用性及准确度，选择适宜的保留时间，综合考虑，最终选择的流动相比例为磷酸盐缓冲液-10%异丙醇（95：5）。

流速对分离的影响 以磷酸盐缓冲液-10%异丙醇（95：5）为流动相，柱温25℃，调节流速为0.9 ml/min、1.0 ml/min和1.1 ml/min，试验结果表明，采用不同流速进行考察，S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗的保留时间均变化较大，但两峰的分离度无明显变化，故选择较为常用的1.0 ml/min流速作为试验色谱条件。

柱温对分离的影响 以磷酸盐缓冲液-10%异丙醇（95：5）为流动相，流速1.0 ml/min，调节柱温为20℃、25℃和30℃，试验结果表明，采用不同柱温进行考察，S,S-阿福特罗与R,R-阿福特罗的保留时间均变化较大，但两峰的分离度无明显变化，故从色谱柱使用寿命角度考虑，选择更接近室温的25℃柱温作为试验色谱条件。

小结 本文建立的手性固定相高效液相色谱法测定酒石酸阿福特罗对映异构体方法的灵敏度高、分离效果好、操作过程简便，可有效的分离检测R,R构型和S,S构型的阿福特罗，为进一步准确评估酒石酸阿福特罗对映异构体的含量提供了较为可靠的检测方法。

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1*通讯作者：陈素洁，女(1985-)，学士，中级工程师。研究方向：药品分析与质量研究。E-mail：kuailesujie@163.com

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