HPLC法测定抗骨增生胶囊中柚皮苷的含量

HPLC法测定 抗骨增生胶囊中柚皮苷的含量

马素芬

苏州恒星医用材料有限公司 ，江苏 苏州 215151

目的： HPLC法对抗骨增生胶囊中的柚皮苷含量。方法：KromasilC18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱,甲醇∶醋酸：水(35：4∶65)为流动相;流速:1.0ml/min;检测波长:440nm，柱温40℃。结果：柚皮苷浓度在5.50～27.48 ug/ ml之间线性关系良好,平均回收率96.62%,RSD=1.1%，结论：该方法简单、可靠、专属性强，可用于抗骨增生胶囊的质量控制。

[关键词]: 抗骨增生胶囊, 柚皮苷 , HPLC

抗骨增生胶囊是熟地黄、鸡血藤、肉苁蓉（酒蒸）、莱菔子(炒)、狗脊（盐制）、骨碎补、女贞子（盐制）、牛膝、淫羊藿等9味中药组成的复方制剂^[1]。具有补腰肾，强筋骨，活血止痛。用于骨关节炎肝肾不足、瘀血阻络证，症见关节肿胀、麻木、疼痛、活动受限。骨碎补为该制剂的主要药物之一，含有柚皮苷等有效成分。原标准中未收载含量测定项 ,本文采用高效液相色谱法对该制剂中的柚皮苷^[2，3]含量进行研究 ,实验结果表明，该法简便易行，灵敏度高，能准确地反映柚皮苷的含量，为更好的控制本品的内在质量提供了科学依据。

1 方法和结果 1.1 仪器与试药　

BP211D型电子天平（赛多利士）；Agilent1100高效液相色谱仪，G1314A VWD检测器（美国安捷伦公司），柚皮苷高氯酸盐对照品 (中国药品生物制品检定所0811-9302),甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；其他试剂为分析纯；抗骨增生胶囊（河南禹州市药王制药有限公司 批号：060302，060604，070703）。

1.2 实验方法和结果

1.2.1 色谱条件

色谱柱：KromasilC18(4.6mm×250mm),流动相：甲醇∶醋酸：水(35：4∶65)为流动相，流速：1.0mL/min，检测波长440nm，进样量：10ul，理论塔板数：5352，柱温：40℃，色谱图见图1。

1.2.2 对照品溶液制备：

精密称取柚皮苷高氯酸盐对照品9.46mg，加3%磷酸甲醇稀释至50ml棕色量瓶，摇匀，制成每1mL 含0.1374mg柚皮苷的对照品储备液（柚皮苷 =柚皮苷高氯酸盐/1.377）。精密量取对照品储备液3ml，加3%磷酸甲醇稀释至25ml棕色量瓶，即得对照品溶液(每1ml中含柚皮苷16.49 ug)色谱图见图1。

1.2.3 样品溶液的制备　

取重量差异项下的内容物，研细，取0.6g，精密称定，置25ml棕色量瓶中，精密加入3%磷酸甲醇20mL，密塞，超声10min，放冷，加3%磷酸甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。色谱图见图2。

1.2.4标准曲线的制备

分别精密取对照品储备液1、2、3、4、5 mL于25ml棕色量瓶中，用3 %磷酸甲醇溶液稀释至刻度 ,摇匀，在上述色谱条件下进样10μl，依法测定。以峰面积（y）为纵坐标，相应浓度（x）为横坐标进行线性回归，得回归方程： y=19.955x+0.2224(R=0.9999) ，线性范围为 5.50~27.48 ug /ml。结果表明峰面积与浓度呈良好的线性关系。

1.2.5 精密度测定
精密取16.49 ug/ml柚皮苷对照品溶液（柚皮苷=柚皮苷高氯酸盐/1.377）10μl

重复进样5次，峰面积基本不变，RSD为1.0%。

1.2.6 重复性测定

取同批号(批号060302)样品5份，分别制备供试液，在上述色谱条件下测定5次，得柚皮苷含量为0.608mg/g，RSD为0.9%

1.2.7 稳定性试验

取同一批供试品溶液（批号060302），于室温放置,每隔2h测一次,共测5次,记录峰面积，RSD为0.5%。

1. 2. 8. 回收率试验　

分别取已知含量的样品(批号060302)6份,各0.15 g,精密称定,分别置于25ml的棕色容量瓶中,精密加入柚皮苷对照品溶液(0.1374mg/ml)各0.5、0.7、0.9ml, 照样品测定法测定，计算回收率，平均回收率96.62%，RSD为1.1%。

1.2.9 空白试验

按处方比例称取除骨碎补以外的其它八味药，按制备工艺制成供试液，依样品测定法测定，在主成分出峰处无干扰(见图3)。

图1对照品色谱图 图2样品色谱图

图3 空白试验图

1.2.10 样品测定　

取样品溶液和对照品溶液，各进样10μL，读取峰面积值，按外标法计算含量(见表1)。

表1 样品含量测定结果（n=3）

2 讨论：

2.1 柚皮苷为色原酮类化合物，性质不稳定，见光易分解，因此本实验的对照品及样品溶液均在棕色容量瓶中，采用3% 磷酸甲醇溶液作为溶剂，可使样品中的柚皮苷转变为柚皮苷的磷酸盐，增强其稳定性。

2.2　提取时间的选择　分别超声处理3，10，15min测定同批样品，结果表明超声处理10min已经提取较完全。

2.2 实验过程中曾尝试乙腈∶0.05mol/l磷酸二氢钠溶液(50∶50)^[4]为流动相，柚皮苷色谱峰与杂质峰未能完全分离，调整流动相为乙腈∶0.05mol/l磷酸二氢钠溶液(35∶65)时能完全分离，且峰形好，柱效高。

2.3 通过试验，确定了抗骨增生胶囊中的柚皮苷含量测定方法，测定结果准确可靠，方法简便，可以作为抗骨增生胶囊质量控制的依据之一。

参考文献

[1] 蒋华科, 陈纯, 陈仲新. 高效液相法测定抗骨增生胶囊中淫羊藿苷的含量[J]. 中国现代药物应用, 2011, 5(12):2

[2] 朱燕, 黄义纯, 严晓明. 高效液相色谱法同时测定抗骨增生胶囊中的毛蕊花糖苷、柚皮苷和淫羊藿苷[J]. 广东药学院学报, 2016, 32(5):4.

[3] 霍艳萍, 刘琴, 高晓燕,等. HPLC法同时测定抗骨增生胶囊中毛蕊花糖苷、松果菊苷、柚皮苷和淫羊藿苷含量[J]. 亚太传统医药, 2016, 12(22):3.

[4] 杨立芳, 宋文耆. 高效液相色谱法测定抗骨增生丸中淫羊藿苷的含量[J]. 中国药房, 2006(18):2.

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