β-地中海贫血的无创产前诊断前景

β-地中海贫血的无创产前诊断前景

许家耀, 郭江鑫,关连鹏,韦瑶瑶

右江民族医学院  本科生 广西百色 533000

摘要：β-地中海贫血亦称海洋性贫血，是由于β珠蛋白肽链综合体异常导致血红蛋白的合成障碍而形成贫血。β-地贫符合常染色体遗传，男女均可发病，代代遗传，怀孕期对高风险妇女进行产前基因诊断以防止重型β-地贫患儿的出生尤为重要，常用的羊膜穿刺法、脐带血、绒毛膜检查增加了患病和流产的风险。因此提高孕妇产前诊断的安全对于优生优育具有重要意义。

关键词：β-地中海贫血；无创产前诊断

β-地中海贫血（β-thalassemia，简称β-地贫）是一种严重危害人类健康的血液病，是一组常染色体遗传病，由于基因缺失或突变导致珠蛋白肽链合成缺如或不足，引起血红蛋白成分异常的溶血性疾病。我国广东、广西为高发区，广西地区的β- 地贫人群携带率达到6.43%，百色为广西之首。β-地贫符合常染色体遗传，男女均可发病，可代代遗传，故β-地贫成为百色严重的地方病和公共卫生问题，常见于出生缺陷。因此怀孕期对高风险妇女进行产前基因诊断、提高孕妇的安全以及筛选出患β-地贫的胎儿对于防止重型β-地贫患儿的出、优生优育、减少围生期并发症具有重要意义。以往对α地贫各方面的研究较多，目前β- 地贫产前诊断，是采集胎儿绒毛、羊水或脐带血样品，采用相应的技术方法进行β- 地贫基因检测，以确定受检胎儿的β- 地贫基因型，这种侵入性的穿刺取样，具有一定的流产风险，并给孕妇带来负面心理影响。所以为了试验采集孕妇外周血，通过检测其血浆中胎儿游离DNA而实现胎儿基因诊断的无创产前诊断技术同时，也是为响应《广西壮族自治区地中海贫血防治计划》在5年内重症地贫患儿减少50%以上而不断努力。

据统计， 全世界约有4.5%的人携带有血红蛋白病致病基因，每年出生的各类重型地贫患儿数至少有20 万。以往对贫血绝大多数的研究是红细胞平均体积（MCV）、红细胞血红蛋白含量（MCH）、异常的血红蛋白及其肽链进行分析[1][2]，对地贫基因主要是分析缺失型α-地贫和突变型β地贫的基因型[3][4][5]，而探讨突变型β-地贫的基因型的极少，尤其在广西地贫这个高发区。无创技术的提出为认识我国地贫的提供了新的资料，对临床准确产前诊断该病预防重型β-地贫胎儿的出生具有重要意义[7]。所以研究无创产前诊断（noninvasive prenatal diagnosis，NIPD）技术在临床应用的价值，填补目前存在的空缺。研究无创技术在临床的应用价值对桂西地区人群β-地贫产前诊断的应用及优生优育指导、遗传学、分子生物学和人类学等有重要价值，并可提高人口素质，减轻社会和家庭负担。同时，也是为响应《广西壮族自治区地中海贫血防治计划》在5年内重症地贫患儿减少50%以上而不断努力。

目前对地贫基因的鉴定方法有多重PCR-电泳技术和巢式PCR-反向杂交技术、PCR-基因测序技术[8][9]。多重PCR又称“复合PCR”，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效性、简便性的特点。巢式PCR使用两对PCR引物扩增完整的片段，第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增，巢式PCR突变位点设计合理，提高了扩增的特异性。对于异常血红蛋白的鉴定方法主要是改良Ingram法[10]。变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是一种新型基因突变检测技术。因为异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。它能够高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。

目前研究人员重心大多集中于孕妇外周血检测血浆中胎儿游离DNA，就诊的怀孕期高风险妇女筛选出来，应用无创技术的方法从体检当天清晨空腹受检孕妇中抽取2ml外周血作为标本，置于EDTA抗凝管中，作为提取基因组DNA，根据基因组DNA提取试剂盒的说明书进行提取。再应用引物设计软件Prime:5.0设计PCR引物，遵循引物设计的基本原则，并且PCR扩增的片段要包括所要检测的基因位点，将设计好的引物合成引物序列扩增得到的PCR产物用相应的限制性内切酶进行切割，然后进行PCR产物的直接测序，每个SNP位点随机选取5-10个进行测序，以验证限制性内切酶反应判断的基因型是否正确，通过运用反向斑点杂交技术（RDB）、基因芯片法、血红蛋白分析（包括液相色谱分析法等方法）和DNA序列测定技术观察血样品的产物或基因序列、位点的等的情况来检测其外周血血浆中胎儿游离DNA，从而实现胎儿基因诊断。

TM是临床上最常见的重型地中海贫血，通过每月输血和定期祛铁治疗，可以提高患者的生活质量，延长寿命。对于TM和因感染、怀孕或手术期间出现血红蛋白浓度下降的TI,应输血治疗。输血的目的是通过提供正常的红细胞，进而控制患者由于贫血所造成的病理生理学改变。目前“定期适量输血”仍是治疗的金标准，使患者血红蛋白维持在90～120 g/L之间，具体方案为每隔3～4周输去白细胞的年轻红细胞10～15 ml/kg,能在纠正贫血和减少不利方面取得平衡。但由于广西地区经济原因及血制品资源的匮乏,给治疗带来了难题，且输血不可避免的出现感染输血传播疾病、产生抗体、输血不良反应及铁过载引起的多器官功能损伤,需寻找新的治疗方法解决这一难题。

地中海贫血作为一种遗传性疾病，目前只能通过造血干细胞移植彻底治愈，移植干细胞的标准来源是骨髓造血干细胞，备选来源是外周血干细胞及脐带血干细胞。由于经济及造血干细胞配型困难等原因，造血干细胞移植一般用于重型地中海贫血患者。最早开始的造血干细胞移植均是来源于捐献者骨盆的骨髓造血干细胞，但由于上述原因及捐献者个人意愿，近年来外周血干细胞及脐带血干细胞逐渐取代了骨髓造血干细胞成为主要的同种异体移植来源。外周血干细胞移植相对骨髓干细胞移植有获取简便、植入速度更快等优点,但慢性移植物抗宿主病发生率在外周血干细胞移植中发生率较高。脐带血干细胞移植较于骨髓干细胞移植具有移植物抗宿主病发病率低、免疫重建快、来源广泛等优点，并且有报道表明脐血干细胞移植的总生存率和无病生存率接近骨髓造血干细胞移植。

研究无创产前诊断（noninvasive prenatal diagnosis，NIPD）技术在临床应用的价值，填补目前存在的空缺。对异常血红蛋白患者，通过多重PCR-电泳技术和巢式PCR-反向杂交技术、PCR-基因测序技术、反向斑点杂交技术等进一步做基因分型鉴定，填补目前存在的空缺。同时了解β-地贫的遗传规律，做好遗传咨询，产前诊断，可减少地贫患儿出生，提高人口素质，减轻社会和家庭负担，,也是为响应《广西壮族自治区地中海贫血防治计划》在5年内重症地贫患儿减少50%以上而不断努力。

参考文献：

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[3]Wang Xia,Jiang Hong,Jia Jin,et al.Screening and Genetic Analysis of Thalassemia in Sichuan District[J].Journal of Biomedical Engineering,2011(28):135-137.

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[9] Min Lin, Jiao-Ren Wu, Li-Ye Yang，Q Wang，L Zhen. Hb G-Waimanalo: occurrence in combination with alpha-thalassemia-1: Southeast Asian deletion. Blood cells, Molecules and Diseases.

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[10]INGRAM VM. Abnormal human haemoglobins. Proc R Soc Med. 2010;51(8):645-6.

第一作者简历：

许家耀，右江民族医学院2018级临床医学本科生。