免疫胶体金标记技术在新型冠状病毒感染的肺炎的应用

免疫胶体金标记技术在新型冠状病毒感染的肺炎的应用

陈祖阵1,涂文瑞 林松2,刘媛娉3,江凌4

三明市中西医结合医院 检验科 福建三明 365001

摘要： 目的 分析免疫胶体金标记技术在新型冠状病毒感染的肺炎的应用。方法 采用回顾性研究方法，收集2020年2月-2020年10月在我市就诊的门诊和住院患者病例48例,根据新型冠状病毒肺炎诊疗标准分为确诊病例组14例,健康对照组34例。以实时荧光RT-PCR为金标准，采用胶体金试剂盒和全自动化学发光分析仪分别对研究对象进行2019-nCoV特异性总抗体检测，分别统计两种检测方法诊断2019-nCoV抗体的诊断性能指标，包括：准确度、敏感度、特异度，并进行统计学检验，分析两种检测方法的一致性。结果免疫胶体金标记检测诊断准确度为95.8%，化学发光法为95.8%；免疫胶体金标记检测诊断敏感度为92.9%，化学发光法为85.7%；免疫胶体金标记检测诊断特异度为97.1%，化学发光法为100.0%，2组间比较均无统计学意义，P均>0.05；两种检测方法检测结果符合率为%，判断一致性K=0.791，具有高度一致性。结论 抗体的检测可以辅助弥补咽拭子核酸检测的不足,化学发光法测定适用于疾病各个阶段，免疫胶体金标记更加快速简便，基层医院可根据患者情况可与核酸检测联合应用。

关键词：新型冠状病毒；抗体检测；胶体金法；化学发光法

Application of immunogold labeling technique in pneumonia caused by New Coronavirus infection

Chen Zuzhen, Lin Song, Tu Wenrui, Liu Yuanping, Jiang Ling

Sanming Hospital of integrated traditional Chinese and Western medicine Sanming 365001 China

Abstract: Objective To analyze the application of immunogold labeling technique in the treatment of pneumonia caused by New Coronavirus. Methods a retrospective study was conducted to collect 48 outpatient and inpatient cases from February 2020 to October in our city. According to the diagnosis and treatment standard of New Coronavirus pneumonia, 14 cases were diagnosed as a case group and 34 cases were in the healthy control group. Taking real-time fluorescent RT-PCR as the gold standard, colloidal gold kit and automatic chemiluminescence analyzer were used to detect 2019 ncov specific total antibody. The diagnostic performance indexes of the two detection methods for 2019 ncov antibody diagnosis were counted, including accuracy, sensitivity and specificity. Statistical tests were carried out to analyze the consistency of the two detection methods. Results the diagnostic accuracy of immunocolloidal gold labeling was 95.8%, and that of chemiluminescence was 95.8%; The diagnostic sensitivity of immunocolloidal gold labeling was 92.9%, and that of chemiluminescence was 85.7%; The diagnostic specificity of immunocolloidal gold labeling was 97.1%, and that of chemiluminescence was 100.0%. There was no significant difference between the two groups (P > 0.05); The coincidence rate of the two detection methods is%, and the judgment consistency is k = 0.791, which is highly consistent. Conclusion the detection of antibody can help to make up for the deficiency of nucleic acid detection of pharyngeal swab. Chemiluminescence detection is suitable for all stages of disease. Immunocolloidal gold labeling is more rapid and simple. Basic hospitals can be combined with nucleic acid detection according to the situation of patients.

自2019年12月以来，新型冠状病毒肺炎患者陆续在武汉被发现确诊，并迅速蔓延我国其他地区以及国外，根据临床初步统计，新型冠状病毒的传播RIO值估计在2-3之间，传播速速度快[1-2]。目前2019冠状病毒病( COVID-19)在全球范围不断的扩散，并在部分国家呈现出爆发的情况，不同地区的发病情况不同。而这主要是由新型冠状病毒( SARS-CoV-2)，入侵人体后引起的一种急性呼吸道传染性疾病。SARS-CoV-2 是目前发现的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种为，人冠状病毒229( HCoV-229)、人冠状病毒NL63( HCoV-NL63)、人冠状病毒0C43( HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1( HCoV-HKU1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒( MERS-CoV)。因此针对该病及早发现、及早检测、及早隔离时治疗和预防的重点，通过早期提高检测手段和诊疗的时效性，在最短的时间将疫情疑似病例，特别是隐性感染者得到快速分流，阻断传染源，做到预防为主，减少疫情的蔓延，同时减低新冠发展成重症，降低死亡率。针对COVID-19的诊断，首先主要集中于病毒核酸的检测,即基于聚合酶链反应( PCR)的核酸检测，已成为SARS-CoV-2检测的金标准。但是由于病毒核酸检测过程对实验室环境、检测人员、仪器要求比较高，并且通常是需要对患者进行鼻拭子、咽拭子、肛门拭子等进行采样、取样。而这就要求我们的采样人员需要在操作过程中需要我们的工作人员，进行对严格的控制感染的风险。由于目前的疑似病例数量较多，如果只靠病毒核酸检测来进行诊断，其工作量太大，并且由于样本的采集手法、样本的各项保存条件、PCR 、操作过程等相关的因素综合性的影响下，可能导致患者出现假阴性和假阳性结果。增加了SARS-CoV-2抗体、抗原检测的方法来，进行辅助诊断，与核酸检测的其他手段可以达到相互补充的结果，可弥补核酸检测时，一旦出现的假阴性和假阳性，以帮助提高疑似病例检测的准确率。而在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》指出[3]，并不将鼻拭子、咽拭子、肛门拭子等检测的手段，作为确诊的方法，而是以血清新型冠状病毒特异性IgM、IgG检测可作为患者确诊方法。目前抗体检测的主要方法是化学发光发和免疫胶体金标记法，两种方法都可以帮助明确诊断，但目前较少研究分析两种检测方法对2019-nCoV抗体的诊断效能指标进行对比，本研究分析两种检测的一致性，为临床提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用回顾性研究方法，收集2020年2月-2020年10月在我市就诊的门诊和住院患者病例48例,根据新型冠状病毒肺炎诊疗标准分为确诊病例组14例，女性5例，男性9例，平均年龄（38.79±11.29）岁，患者均在两次核酸检测报告中显示阳性，且发病时间在7d以上；健康组34例，女性19例，男性15例，平均年龄（39.05±11.30）岁，无流行病学史、临床症状及影像学特征，核酸检测呈阴性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 抽取患者的空腹静脉血5mL后，放置于提前准备的抗凝管内，并且静置30min后，置于离心机内进行分离，后取上层的血清备用，准备给予检查所用。

1.2.2 化学发光法 使用Caris200的全自动化学发光分析仪（亚辉龙），并且采用IgM、IgG的检测试剂盒进行相关的检测，并且要运用吖啶酯化学发光原理进行对标本的相关检测。结果判读的标准：阴性结果的标准：样本S/CO值<1.0；阳性结果的标准：样本S/CO值≥1.0。

1.2.3 免疫胶体金标记法实验检测 采用新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（南京诺唯赞医疗科技有限公司），并且将采集的血液、体液标本，不经过相关的处理，而直接取50ul滴在检测孔上；粪便标本有生理盐水适当稀释后取50ul滴在检测孔上，5-10min后观察结果。结果判读标准：阴性结果的标准：只出现对照斑点；阳性结果的标准：对照斑点、检测斑点都显色；无效结果的标准：无任何斑点出现。

1.3 观察指标 分别统计两种检测方法，在对诊断2019-nCoV抗体的诊断性能指标，本次的研究结果方向主要是包括：准确度、敏感度、特异度的相关判读与分析，并进行统计学检验，帮助分析两种检测方法的一致性。

1.4 统计学方法 本研究所采用SPSS 21.0的软件进行相关的数据分析，研究结果中的正态计数资料，则以%表示，组间的比较需采用2检验；而病毒核酸检测结果采用Kappa一致性检验，Kappa值为>0.5，则说明一致性较好；P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法检测抗体结果免疫胶体金标记检测和化学发光法检测均具有较高准确度和敏感度，2组间比较均无统计学意义，P均>0.05，见表1、2。

表1 两种检测方法检测结果

表2两种检测方法检出率比较（%）

2.2 两种检测方法一致性两种检测方法检测确诊组和对照组结果符合率分别为95.8%、95.8%，判断一致性K=0.802，具有高度一致性。

3 讨论

自2019年12月有相关数据中表示到今天，最早的中国湖北省武汉市陆续出现，咳嗽、发热等症状的患者，经过诊断时原因不明的肺炎病例。而在早期的数据中指出，从发现病例确诊后，截至2020年3月24日，中国累计确诊病例数据为81218例,而由此所引发的死亡病理为3281例。而放眼在国际临床中，在海外其他国家(包括是排名前5位的国家的韩国、日本、伊朗新加坡，意大利)中,经过确诊后，所获得的累计确诊病例也有2309例,其中33例死亡。并且在2020年 1月7日，经过相关的检查后，中国疾病预防控制中心，将该病原确定为新型冠状病毒，并将其命名为“2019- mCoV" ，属于“SARS COV-2”的一种。而在2020年1月12日，在世界卫生组织上，并正式的将造成这次疫情的新型冠状病毒，命名为“2019 nCoV"。并于2020年2月11日，又将新型冠状病毒感染所造成的因为病毒诱发出的肺炎，正事的命名为“COVID-19”。并且在经过初步流行病学调查的结果后，将武汉的华南海鲜市场，确定新型冠状病毒肺炎为事件的最初爆发地点。

当新型冠状病毒入侵，并感染人体后，由于人体的机体自身的免疫能力，在感受到外界的刺激后，才会在一定的程度上，达到激活人体的免疫系统，并最终的，在机体内产生具有保护作用的蛋白抗体IgG和IgM。而新型冠状病毒肺炎的危重症患者中，有一半以上会发生炎症风暴，即全身性炎症反应综合症(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)[4-5]，可导致呼吸窘迫综合征和多器官衰竭且发展十分迅速，往往一天之内就会从轻症突变成重症或者危重症，极大增加患者快速死亡的风险，这个也是目前新冠死亡最主要的原因[6-7]。SIRS一旦发生，没有即刻有效的治疗办法，因此死亡率非常高[8]。基于IgG和IgM的诊断指标已经被归入新型冠状病毒肺炎（简称“新冠肺炎”）治疗计划（试行第7版），实现对核酸检测的有效补充，通过联合诊断的方法,实现对新冠肺炎诊断准确率不断提高的目的。Cov-2高度同源一直是临床疑似病例的确诊标准，但核酸检测受样本采集、存放和病毒感染部位、检测耗时时间长等多种因素影响，因此为了快速确诊和防控，在基层医院可联合抗体检测辅助检查。胶体金免疫层析法是20世纪末发展利用胶体金纳米粒子作为标志物,并结合免疫识别技术和层析技术的一种现场、快速检测方法。根据胶体金显色强度，实现信号强弱的快速判断，是一种新型技术。利用该技术能很大程度上，缩短检测时间并兼具准确性，可以在基层早期病情诊断中发挥有效作用。在本研究结果中显示，免疫胶体金标记检测诊断准确度、敏感度和特异度分别为95.8%、92.9%、97.1%，化学发光法分别为95.8%、85.7%、100%，2钟检测方法均具有较高准确度和敏感度，2组间比较无统计学意义（P均>0.05），说明两种检测方法敏感度和特异度均能达到临床要求，但在应用价值上各有优缺点。有研究显示[9-10]，化学发光法可做到相对定量，高通量、结果可靠性强，适合综合医院大规模筛查，而免疫胶体金标记结果无法定量，但无需大型设备，操作便捷，更适用于基层医院和社区筛查检测。而由于胶体金浓缩的倍数，其对于最后试纸条上显色效果，则具有重要的决定性作用。而对胶体金纳米粒子的溶液，进行不同程度的浓缩，然后对重组抗原进行标记，也是帮助明确诊断结果的方法。本研究结果与其相同，在本研究结果中应用免疫胶体金标记检测有2例患者呈现假阳性且对疑似患者检查时有11例患者出现误诊，究其原因可能是免疫胶体金标记对于弱阳性结果依靠肉眼判断较为困难，易受其他因子干扰物质干扰，出现假阳性结果。在本研究结果中显示，两种检查方法判断一致性K=0.802，具有高度一致性。以往研究中对于两种抗体检查方法结果中表明[11-12]，结果一致性K=0.826，但两种检查方法均存在假阴性和假阳性的可能。本研究结果与其基本相同，说明两种检查方法均是辅助临床核酸检查的首选方法，免疫胶体金标记检测是通过胶体金在还原剂的作用下聚合成带负电的疏水胶溶液，胶体以金颗粒为核，表面吸附双层离子后与蛋白质分子及其它非共价的生物大分子正电荷基团形成静电结合，且不影响其生物特性，不仅具有较高特异性和准确性，弥补了检测方法对人员和设备的限制。

综上所述，抗体的检测可以辅助弥补咽拭子核酸检测的不足,化学发光法测定适用于疾病各个阶段，免疫胶体金标记更加快速简便，基层医院可根据患者情况可与核酸检测联合应用，但由于本研究样本量较小，因此结论具有一定局限性。

参考文献

[1]罗效梅,王静,张娅, 等.全血SARS-CoV-2特异性抗体检测对2019-冠状病毒病的临床应用价值分析[J].西南大学学报（自然科学版）,2020,42(3):30-34. DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2020.03.005.

[2]吴楠,刘飞,陈付凉, 等.血清2019-nCoV IgM/IgG检测在COVID-19快速诊断中的应用研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2020,40(8):579-583. DOI:10.3760/cma.j.cn112309-20200307-00105.

[3]童伟,陈登奕,陈俊文, 等.2019-nCoV总抗体两种免疫学检测方法的应用评价[J].现代检验医学杂志,2020,35(2):80-82. DOI:10.3969/j.issn.1671-7414.2020.02.023.

[4]鲍腾飞,顾军娟,刘颖娟, 等.免疫层析法检测SARS-CoV-2IgM、IgG抗体的临床应用价值[J].武汉大学学报（医学版）,2020,41(5):689-692. DOI:10.14188/j.1671-8852.2020.0193.

[5]王远芳,邓杰伦,敖科萍, 等.三种SARS-CoV-2抗体胶体金试剂诊断效能评价及假阳性控制策略探讨[J].中国呼吸与危重监护杂志,2020,19(3):214-218. DOI:10.7507/1671-6205.202003194.

[6]谭明凯,区静怡,黄颖, 等.新型冠状病毒3种抗体试剂盒的性能评估及临床应用初探[J].中华微生物学和免疫学杂志,2020,40(4):250-255. DOI:10.3760/cma.j.cn112309-20200303-00097.

[7]陈富强,朱海峰,肖晨, 等.新型冠状病毒康复者血浆IgM和IgG不同试剂检测结果的差异分析[J].临床输血与检验,2020,22(3):258-263. DOI:10.3969/j.issn.1671-2587.2020.03.009.

[8]郑培明,崔发财,张福明, 等.新型冠状病毒IgM和IgG抗体不同检测方法在新型冠状病毒感染中的临床应用评价[J].检验医学,2020,35(4):291-294. DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2020.04.001.

[9]李晖,李咏茵,张志高, 等.2019新型冠状病毒抗体胶体金检测方法的建立与临床性能评价[J].中华传染病杂志,2020,38(3):139-144. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2020.03.003.

[10]贾兴旺,刘青,陈泽衍, 等.胶体金法检测血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体的临床应用及干扰因素分析[J].标记免疫分析与临床,2020,27(5):845-849. DOI:10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2020.05.027.

[11]肖秀美,段京京,吴思沂, 等.新型冠状病毒IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测的假阳性分析[J].中华检验医学杂志,2020,43(11):1080-1085. DOI:10.3760/cma.j.cn114452-20200515-00474.

[12]张稳健,吕欣,黄驰, 等.胶体金免疫层析法检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的临床评价与应用[J].病毒学报,2020,36(3):348-354. DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003676.

陈祖阵

籍贯:福建大田

性别:男

出生年月日:1986.10.16

学历:本科

职称:主管技师

研究方向:辅助生殖技术

三明市科技计划项目

项目编号：2020-S-4